Name: Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Impara la tecnica di patch clamp su ovociti di Xenopus laevis per studiare i canali ionici. Questo metodo include la rimozione della membrana vitellina e la formazione del sigillo gigaohm per misurazioni elettrofisiologiche accurate.

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Ricetta soluzione restringimento è dal laboratorio di RW Aldrich. Ringraziamo le seguenti agenzie di finanziamento e le fondazioni per il supporto: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Associazione distrofia muscolare, il B. e Donald E. Delia Baxter Foundation, il Fondo Klingenstein McKnight e il Endowment for Neuroscience.

Parte 1: Rimozione della membrana vitellina <ol><li> Preparare due serie di pinze. Noi preferiamo n ° 5 pinze, dove un gruppo è stata leggermente affilato con una lima. Anche preparare una pipetta di vetro trasferimento da taglio e la lucidatura fuoco un 7 &quot;pipetta Pasteur. </li><li> Consigliato: Per evitare che gli ovociti di scivolare, tagliare un cerchio di griglia (1 quadrati mm) e colla nel fondo di un piatto 60 millimetri Petri. Questo piatto può essere riutilizzata all&#39;infinito se tenuto pulito tra usi. </li><li> Riempire la piastra Petri con una soluzione a metà strada iperosmotico (vedi ricetta) e posto sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Rimuovere 1-3 ovociti di Xenopus dalla loro soluzione di incubazione con una pipetta Pasteur e lucido posto nel piatto. </li><li> Attendere 15s - 2 minuti per le cellule di cominciare a ridursi. Tempi più lunghi rendere le cellule più facile da sbucciare, più brevi tempi di cellule sane per l&#39;applicazione di patch. </li><li> Come si contrae il cellulare, la membrana vitellina inizierà a diventare quasi invisibili come uno strato trasparente sopra la cella. Selezionare una cellula sana (senza spirali o difetti) per peeling. </li><li> Con un paio di pinze, prenda delicatamente la membrana vitellina senza danneggiare la membrana plasmatica. Con l&#39;altra, afferrare vicino al luogo stesso e delicatamente strappare la membrana trasparente a parte e libera della cellula. </li><li> Con la pipetta Pasteur, con attenzione spostare la cella alla camera di registrazione. Si noti che la cellula sarà fragile dopo la rimozione vitellino. </li></ol> Parte 2: generazione Gigaseal <ol><li> Riempire una pipetta di registrazione con soluzione salina. Utilizzare il volume minimo di soluzione che rende un buon contatto elettrico con il filo elettrodo in modo da minimizzare capacità pipetta. </li><li> Flick i tempi pipetta diversi per consentire bolle di galleggiare e scivolare sul filo elettrodo. Applicare una pressione al pipetta riempita. Questo può essere fatto per via orale o con una pompa da acquario un negozio di animali. Questa pressione è fondamentale per mantenere la pipetta pulisce mentre attraversa l&#39;interfaccia liquido e si sposta alla cella. </li><li> Trova l&#39;ovocita nella camera e concentrarsi fortemente sul bordo della cella. </li><li> Con la pipetta dal bagno, il centro (fuori fuoco) punta sopra la cella. Questa volta minimizza trascorso in bagno prima generazione di tenuta. </li><li> Cadere la pipetta fino a fuoco vicino alla cella. Portarlo in prossimità (~ 50 micron). Si dovrebbe vedere una piccola distorsione della soluzione spinto fuori la pipetta dalla pressione posteriore. </li><li> Utilizzando il software di patch clamp, verificare la resistenza della pipetta (il nostro obiettivo è circa 3-4 MΩ) e zero la corrente con la tensione di offset. </li><li> Con una pressione positiva sulla pipetta, spostare la punta lentamente verso la cellula durante il monitoraggio della resistenza visivamente o utilizzando un monitor audio che genera un segnale la cui frequenza è proporzionale alla resistenza. Come la punta comincia a toccare il cellulare, la resistenza aumenta. </li><li> Improvvisamente, ma delicatamente, passare da positivo a pressione negativa di circa lo stesso valore assoluto. Resistenza deve aumentare per sigillare formazione. </li><li> La maggior parte del tempo, la formazione di tenuta avviene all&#39;interno di alcuni secondi, a volte 30-60 secondi sono obbligatori. </li><li> Una volta che la resistenza è a 1GΩ, la pressione può essere rilasciato in folle. Avete ora un in-cell patch. Per un inside-out patch, tirare fuori dalla cella rapidamente. Per i fuori-fuori, vedi sotto. </li></ol> Parte 5: Fuori-out topologia (opzionale) <ol><li> Immediatamente dopo aver ottenuto una gigaseal, rottura della membrana. Questo può essere fatto con aspirazione forte, ma noi preferiamo una V 1 impulso di 1 ms. La resistenza dovrebbe scendere a poco più di pipetta della resistenza iniziale. </li><li> Spostare la pipetta dalla cellula lentamente e dolcemente. Si dovrebbe vedere una sezione del tiro cella con la pipetta. Improvvisamente, e nel giro di pochi secondi, la cellula ritornerà e la resistenza dovrebbero immediatamente e simultaneamente tornare a GΩs. </li><li> Ora avete un cerotto nella parte esterna-out configurazione. Il ectodomains di canali ionici incluso è esposto al bagno. </li></ol> Parte 6: risultati attesi In generale, le foche maggiore resistenza sono preferibili e più a lungo vissuto. 10 GΩ è una buona indicazione di alta qualità foche. Nella nostra esperienza, le possibilità di ottenere sigilli di questa qualità varia a molti fattori, in particolare delle cellule e pipetta di qualità. Velocità di acquisizione patch può essere superiore al 95% con le cellule sane, pipette pulite, e un ricercatore confermato. Queste patch possono durare per molti minuti e sono adatti per qualsiasi studio elettrofisiologico dei canali ionici espressi in ovociti di Xenopus, tra cui un canale registrazioni.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Ci sono molti parametri di registrazione elettrofisiologica non discusso qui. Installazione impianto di perforazione, il rumore del sistema di gestione, espressione dei canali e protocolli di registrazione sono anche fondamentali per buoni risultati sperimentali. Nella nostra esperienza, questi sono i parametri più critici per formare guarnizioni affidabile: gli ovociti di qualità, eliminando la membrana vitellina velocemente (aka, &quot;peeling&quot;), utilizzare pipette appena tirato al riparo dalla polvere, pipette liscio, pressi...

<table><tbody><tr><td>Amplificatore per tecnica del patch clamp &amp;amp; Software</td><td>Strumento</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>o altro dispositivo analogo (ad es. HEKA EPC-9 o Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>Pinzette n. 5 (due paia)</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per il restringimento dell'ovocita</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Ingrediente In mMN-metil-D-glucammina 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Acido aspartico 220KCl 2pH 7,4 con N-metil-D-glucammina</td></tr><tr><td>maglia intrecciata</td><td>800 µm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

patch di registrazione pinza dei canali ionici espressa in ovociti di xenopus

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Dal suo sviluppo da Sakmann e Neher 1, 2, la patch clamp si è affermata come una tecnica estremamente utile per la misurazione elettrofisiologica dei canali ionici singole o multiple nelle cellule. Questa tecnica può essere applicata a canali ionici, sia il loro ambiente nativo ed espresso in cellule eterologhe, come gli ovociti raccolti dalla rana africana artigliata, Xenopus laevis. Qui, descriviamo la consolidata tecnica di registrazione patch clamp da ovociti di Xenopus. Questa tecnica viene utilizzata per misurare le proprietà dei canali ionici espressi sia nelle popolazioni (macropatch) o singolarmente (un solo canale di registrazione). Ci concentriamo sulle tecniche per ottimizzare la qualità della preparazione degli ovociti e la generazione di tenuta. Con tutti i fattori ottimizzato, questa tecnica dà una probabilità di generazione sigillo di successo superiore al 90 per cento. Il processo può essere ottimizzato in modo diverso da ogni ricercatore sulla base dei fattori lui o lei trova la più importante, e vi presentiamo l&#39;approccio che hanno portato al più grande successo nelle nostre mani.

Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Da quando è stata sviluppata da Sakmann e Neher 1, 2, la tecnica del patch clamp si è affermata come un metodo estremamente utile per l'elettrofisiologia...

Questa procedura inizia con la rimozione della membrana vilina dai citi di Opus al fine di formare con successo sigilli con resistenza del gigaohm, necessari per le registrazioni con tecnica del patch clamp. Una volta ottenuta la configurazione del patch clamp in cellula, si può applicare una depressione alla pipetta per ottenere l'accesso elettrico al citoplasma della cellula, nota come configurazione del patch clamp in intero. La punta della pipetta può quindi essere allontanata dalla membrana plasmatica fino a quando non si stacca bruscamente, ottenendo così un piccolo frammento di membrana in cui i domini ecto dei canali sono esposti alla soluzione del bagno; questa configurazione è nota come configurazione "outside-out". Ciao, sono Austin Brown del laboratorio della dottoressa Miriam Goodman del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford.E io sono Brandon Johnson, anch'io del laboratorio Goodman. In un video precedente, abbiamo dimostrato come realizzare pipette per il patch clamp ed elettrodi affilati per l'elettrofisiologia. Oggi presenteremo un'introduzione alla registrazione con tecnica patch clamp di canali ionici espressi in zpa.Pertant

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Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi...

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

Descriviamo un metodo per quantificare l'attività delle ATPasi di tipo P che controtrasportano K+ mediante l'espressione eterologa degli enzimi negli ovociti di Xenopus e misurando l'assorbimento di Rb+ o Li+ nelle singole cellule mediante spettrofotometria di assorbimento atomico. Il metodo è un'alternativa sensibile e sicura agli esperimenti di flusso di radioisotopi, facilitando studi cinetici complessi.

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

Abbiamo sviluppato una preparazione intatto midollo cerebrale-spinale per registrare e monitorare l'attività elettrica tramite registrazione patch clamp da neuroni e altre cellule Mauthner reticulospinal in embrioni di zebrafish. Quindi, siamo in grado di registrare le correnti sinaptiche eccitatorie e inibitorie, attività del canale voltaggio-dipendente e potenziali d'azione dai neuroni chiave in un embrione in via di sviluppo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

L'approccio gap vaselina cut-aperto viene utilizzato per ottenere bassi registrazioni sonore di correnti ioniche e gating di canali ionici voltaggio-dipendenti espressi in oociti di Xenopus con alta risoluzione di canale cinetiche veloci. Con piccola modifica, morsetto di tensione fluorometria può essere accoppiato al protocollo ovocita cut-open.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l'iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza.

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

Qui presentiamo un protocollo per esprimere le proteine gap junction negli ovociti Xenopus e registrare la corrente giunzionale tra due ovociti apposti utilizzando un amplificatore commerciale progettato per registrazioni a doppio morsetto di tensione degli ovociti in una modalità di misurazione della corrente laterale elevata.

Registrazione della corrente di giunzione gap dagli ovociti xenopus

Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

Impara la tecnica di patch clamp su ovociti di Xenopus laevis per studiare i canali ionici. Questo metodo include la rimozione della membrana vitellina e la formazione del sigillo gigaohm per misurazioni elettrofisiologiche accurate.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

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