Name: Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Impara a modellare micropipette di vetro con calore e pressione d'aria per registrazioni patch-clamp a basso rumore su piccole cellule. Questa tecnica migliora la qualità dei dati in elettrofisiologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La pressione di lucidatura tecnica è stata sviluppata in collaborazione con Lockery SR.

Pipette tirando Utilizzando un filamento estrattore come un Sutter P-97 Flaming Puller microelettrodo / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette. <ol><li> Seleziona il tuo bicchiere. Noi usiamo borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere. </li><li> Progettare un programma di trazione. L&#39;obiettivo primario è una punta di apertura circa la dimensione desiderata, che dipende dalla applicazione. Sutter P-97 Cookbook Pipettare 2 è un eccellente punto di riferimento. </li><li> Osservate la vostra pipette al microscopio per determinare diametro di apertura e morbidezza. Eliminare ruvido, consigli irregolare, o irregolari. Per la registrazione standard di patch clamp, un&#39;apertura punta che è di 2-4 micron tutto è meglio. Una punta smussata porta ad una minore resistenza per il diametro dell&#39;apertura stessa, che si preferisce. Forma e dimensioni possono essere modificate durante la lucidatura, di seguito. </li></ol> Pressione lucidatura pipette <ol><li> Collegare un titolare pipetta con una linea pulita ed aria compressa. Utilizzando un regolatore, impostare la pressione dell&#39;aria compressa linea a ~ 40 PSI. Collegare la linea di aria compressa ad una valvola a 4 vie di controllo che permetterà la pressione titolare pipetta ad essere attivata e disattivata. Collegare un titolare pipetta alla valvola di controllo con una lunghezza di ⅛ in Tygon ® tubazione. </li><li> Utilizzare un impianto di lucidatura (microforge) con un alta pressione titolare pipetta, una bobina di lucidatura controllato da un pedale, un microscopio equipaggiato con un ingrandimento basso e alto, lunga distanza (idealmente, 10x e 100x) aria obiettivi. E &#39;fondamentale essere in grado di osservare l&#39;apertura pipetta durante il protocollo. </li><li> Opzionale: Cappotto la pipetta con un isolante idrofoba per diminuire capacità e migliorare le caratteristiche del rumore (vedi &quot;pipette Pulling&quot; per questa tecnica). </li><li> Verificare che la valvola è in posizione off. Inserire una pipetta nel supporto pipetta e stringere il raccordo di a mano. Nota di sicurezza: se la pipetta venga mantenuta ferma nel supporto pipetta, la pressione dell&#39;aria provoca la pipetta di essere espulso dal titolare pipetta. </li><li> Posizionare la pipetta e titolare nel microforge. Posizionare il titolare pipetta sul palco microscopio in modo che sia la punta e la bobina lucidatura sono visibili in basso (10x) accendere il microforge. Portare la punta ~ 75 micron dal filamento. Tieni presente che il filamento si espande quando riscaldato. </li><li> Passare alla elevata potenza (100x) obiettivo. Sia la punta della pipetta e la bobina lucidatura dovrebbe essere a fuoco e nel campo di vista. In caso contrario, regolare l&#39;altezza della bobina lucidatura. (La posizione della pipetta non può essere regolata). La punta della pipetta e la bobina di lucidatura dovrebbe essere vicino ai lati opposti del campo visivo. Evitare di posizionare la bobina troppo vicino alla punta della pipetta, perché si espanderà in caso di riscaldamento e di rilievo nella vostra pipetta. </li><li> Girate la valvola per dirigere l&#39;aria pressurizzata nella pipetta, e il calore la punta della pipetta fino a quando il cono dietro la punta comincia a palloncino verso l&#39;esterno. </li><li> Interrompere il riscaldamento prima che la punta palloncini troppo ampiamente. La sperimentazione è necessaria per determinare la distanza appropriata, il calore, e il tempo per la forma desiderata. </li><li> Opzionale: ridurre il diametro di apertura punta da lucidare la punta, in assenza di pressione. I punti 7 e 8 può ripetere per mettere a punto sia la forma e le dimensioni della punta della pipetta. </li><li> Spegnere la pressione e puntando la punta della pipetta in una direzione sicura, rimuovere la pipetta e metterla in un contenitore pulito, dove sarà protetta dalla polvere. Nota di sicurezza: Se la pressione dell&#39;aria non è spento, la pipetta può essere espulso dal titolare pipetta durante la rimozione. </li></ol> Note sui microforge Usiamo un microforge assemblato da off-the-shelf parti disponibili in commercio. (È possibile anche acquistare un kit di lucidatura pressione da alcune aziende, ad esempio, ALA Scienza, GlassWorx). Indipendentemente dal microforge, è essenziale avere ottiche che sono buone abbastanza per vedere l&#39;apertura punta, che è spesso solo un paio di micron di diametro. Usiamo un lungo lavoro obiettivo 100x a distanza per questo scopo. Inoltre, il cappotto la bobina di lucidatura ad alta temperatura di fusione del vetro in modo da minimizzare il deposito di metallo vaporizzato sul pipette. Parte 3: risultati attesi Lucidatura moderata pressione può ridurre la resistenza di una pipetta senza modificare sensibilmente l&#39;apertura diametro. Se lo si desidera, questo protocollo può essere usato per fare pipette con sub-micron aperture e resistenze tra 5-10MΩ.

<ol><li>Goodman, M. B., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+polishing%3A+a+method+for+re-shaping+patch+pipettes+during+fire+polishing.%C2%A0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. .</a> J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).</li>
<li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Inizialmente abbiamo sviluppato questo metodo per pipette utile per patch-clamp registrazione 2-3 micron neuroni in C. elegans 1. E &#39;in uso di routine nel laboratorio Goodman. Noi pipette pressione smalto non solo per la registrazione da piccolo C. elegans neuroni, ma anche per l&#39;ottenimento di registrazioni macropatch e single-channel dei canali ionici espressi in ovociti di Xenopus. Per un dato in punta di apertura del diametro, la forma smussata produce una minore resistenza pipetta. Resistenza pipett...

<table><tbody><tr><td>Capillari di vetro</td><td>Consumabile</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-85-10 (o simili)</td><td>Il metodo funziona con qualsiasi tipo di capillare, tranne quelli in quarzo. Tuttavia, si consiglia di utilizzare capillari con filamento interno.</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL (o simili)</td><td>Qualsiasi microscopio invertito semplice è adeguato. È tuttavia essenziale disporre di un ingrandimento sufficiente per vedere le pipette durante la lucidatura. A tale scopo, utilizziamo un obiettivo metallografico da 100x con lunga distanza di lavoro.</td></tr><tr><td>Kit microforge</td><td>Strumento</td><td>ALA Science</td><td>CPM-2</td><td>Fornisce bobina per lucidatura, controller e pedale.</td></tr><tr><td>Sorgente di pressione d'aria</td><td>Strumento</td><td>ALA Science</td><td>PR-60</td><td>Accessorio per fornire alta pressione, include una valvola adatta. In alternativa, si può utilizzare l'aria compressa dell'edificio abbinata a un filtro/regolatore (impostato a 40 PSI) e a una valvola a 4 vie (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Valvola a 4 vie</td><td>Strumento</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-98150-01</td><td>Saranno necessari raccordi per collegare la valvola al tubo</td></tr><tr><td>Portapipetta con connettore Luer</td><td>Strumento</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH-6S20</td><td>Utilizzare un raccordo maschio Luer-a-barb per collegare il portapipetta al tubo ad alta pressione</td></tr><tr><td>Tubazione Tygon&amp;#174;</td><td>Strumento</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408-62</td><td>Utilizzare questa tubazione per collegare il portapipetta alla valvola a 4 vie</td></tr></tbody></table>

pressione lucidatura pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressione lucidatura è un metodo per modellare pipette di vetro per patch-clamp registrazione. In primo luogo abbiamo sviluppato questo metodo per la realizzazione di pipette adatto per la registrazione di piccole dimensioni (&lt;3 m) corpi cellulari neuronali. Il principio di base è simile al vetro soffiato e combina la pressione dell&#39;aria e del calore per modificare la forma di pipette di patch preparata da un estrattore micropipetta convenzionale. Può essere applicato ai cosiddetti soft (calce sodata) e difficile (borosilicato) occhiali. In generale, la lucidatura della pressione può ridurre la resistenza pipetta del 25% senza diminuire il diametro dell&#39;apertura punta (Goodman e Lockery, 2000). Può essere applicato a qualsiasi tipo di vetro e richiede solo l&#39;aggiunta di un valvola di alta pressione e montato su un microforge. Questa tecnica è essenziale per la registrazione da cellule ultrasmall (&lt;5 m) e può anche migliorare singolo canale di registrazione, riducendo al minimo la resistenza pipetta. La forma smussata è utile anche per la registrazione perforata-patch clamp, perché i risultati in forma di questa punta una bozza membrana più disponibile per la perforazione.

Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell&#39;aria la conicità è allargato senza aumentare l&#39;apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

La lucidatura a pressione è un metodo per modellare pipette di vetro per registrazioni patch-clamp. Abbiamo sviluppato inizialmente questo metodo per fabbricare pipette idonee per...

Questa procedura inizia posizionando la punta della pipetta vicino al filamento di lucidatura a un ingrandimento di 100 volte. Successivamente, accendere la pressione dell'aria e il riscaldamento. Il filamento.La punta della pipetta si espanderà formando una punta arrotondata. Spegnere il riscaldamento per ottenere un'apertura più piccola. Spegnere nuovamente la pressione e il riscaldamento.Ciao, sono Brandon Johnson del laboratorio della dottoressa Miriam Goodman del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford. Oggi vi mostreremo una procedura per la lucidatura a pressione delle pipette per il patch-clamp. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare canali ionici, membrane cellulari e neuroni di C. elegans.Iniziamo. Prelevare un set di sei-dieci pipette per il patch. Consultare un esperto locale o il nostro esperimento illustrato sulla preparazione di pipette per il patch e di elettrodi affilati con un polar programmabile per ottenere assistenza.Per iniziare la procedura, impostare la pressione dell'aria compressa a circa 40 PS.I, quindi collegare la tubazione dell'aria compressa a una valvola di controllo a quattro vie. Colle

pressure-polishing-pipettes-for-improved-patch-clamp-recording

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra come utilizzare un estrattore programmabile per rendere pipette cerotto e gli elettrodi taglienti per elettrofisiologia. La stessa procedura può essere usato per fare una varietà di strumenti in vetro, tra cui aghi da iniezione.

Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

Usiamo il patch-clamp per misurare GABA-activated monocanale correnti (GABAA canali, recettori GABA) e le correnti sinaptiche e tonico che generano nei neuroni. L'attivazione dei canali diminuisce l'eccitabilità neuronale nella salute e nella...

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

Questo protocollo descrive una tecnica chiamata elettrofisiologia del patch clamp a cellula intera, che è un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni di Mauthner e di altre cellule reticolospinali negli embrioni di zebrafish.

Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

Questo video mostra una tecnica per la registrazione patch-clamp dalla superficie della membrana dendritica. Questo aiuta a esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e dei canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti nei neuroni dopaminergici.

Registrazioni Patch-Clamp dal dendrite di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello

Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Le registrazioni subcellulari di patch-clamp offrono la possibilità di studiare le proprietà funzionali dei dendriti. Tuttavia, queste strutture fini non sono facilmente accessibili a causa del loro piccolo diametro. Il protocollo qui descritto mira a facilitare la raccolta di registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici in fette in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

Questo protocollo descrive come eseguire registrazioni elettriche da spermatozoi di mammifero in una configurazione a cellula intera, con l'obiettivo di registrare direttamente l'attività dei canali ionici. Il metodo è stato determinante per descrivere i profili elettrofisiologici di diversi canali ionici degli spermatozoi e ha contribuito a rivelare la loro identità molecolare e regolazione.

Registrazione delle correnti elettriche attraverso la membrana plasmatica degli spermatozoi dei mammiferi

Di seguito sono presentati metodi che forniscono istruzioni dettagliate per la dissezione, la dissociazione, la coltura e la registrazione di patch-clamp dai neuroni gangliari vestibolari e gangliari a spirale dell'orecchio interno.

Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per misurare direttamente l'attività dei canali ionici sulle vescicole intracellulari utilizzando un sistema manuale di patch-clamp endolisosomiale. Illustriamo il metodo che prevede l'ingrandimento degli endolisosomi e l'isolamento manuale di queste vescicole. Questo approccio garantisce che i ricercatori possano replicare e applicare accuratamente la procedura.

Tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

Impara a modellare micropipette di vetro con calore e pressione d'aria per registrazioni patch-clamp a basso rumore su piccole cellule. Questa tecnica migliora la qualità dei dati in elettrofisiologia.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Esplora altri video