Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione
22 ottobre 2008
Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.
Questa procedura inizia posizionando la punta della pipetta vicino al filamento di lucidatura con un ingrandimento di 100 volte. Quindi accendi la pressione dell'aria e il calore. Il filamento.
La punta della pipetta si espanderà per formare una punta di forma smussata. Spegnete il fuoco per ottenere un'apertura della punta più piccola. Spegnere la pressione e riscaldare di nuovo.
Ciao, sono Brandon Johnson del laboratorio della dottoressa Miriam Goodman presso il Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford. Oggi vi mostreremo una procedura per le pipette per cerotti con lucidatura a pressione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i canali ionici e i cerotti di membrana e i neuroni NC elgan.
Quindi iniziamo. Estrarre un set da sei a 10 pipette per cerotti. Consulta un esperto locale o il nostro esperimento visualizzato che realizza pipette per patch ed elettrodi affilati con una polare programmabile per assistenza.
Per iniziare la procedura, impostare una pressione dell'aria compressa a circa 40 PS. Quindi collego l'aria compressa a una valvola di controllo a quattro vie. Collegare un pezzo di tubo di plastica alla valvola a quattro vie e collegare un supporto per pipetta ad alta pressione all'estremità libera del tubo di plastica. Utilizzare un impianto di micro forgiatura per eseguire la lucidatura.
Utilizziamo il kit Ccpm two di LA Scientific. Questo banco di perforazione è dotato di un portapipette ad alta pressione, di un filamento riscaldante in platino controllato da un pedale e di un microscopio dotato di un ingrandimento basso e alto di 10 volte in 100 volte di lunghezza. Gli obiettivi ad aria a distanza di lavoro sono ideali perché è fondamentale poter osservare l'apertura della pipetta durante il protocollo.
Quindi, verificare che la valvola di pressione sia in posizione off. Quindi posizionare una pipetta nel supporto della pipetta e serrare il raccordo a mano per la sicurezza del laboratorio. Assicurarsi che la pipetta sia tenuta saldamente nel portapipetta.
In caso contrario, la pressione dell'aria causerà l'espulsione della pipetta dal supporto. Come passaggio facoltativo, è possibile rivestire la pipetta con un isolante idrofobico come la cera per ridurre la capacità e migliorare le caratteristiche di rumore. Posizionare ora la pipetta nel supporto nella microforgia, posizionare il supporto della pipetta sul tavolino del microscopio in modo che sia la punta che il filamento di lucidatura siano visibili a una potenza bassa di 10 volte sulla microforgia.
Portare la punta a circa 50 micron dal filamento, quindi passare all'obiettivo 100 ad alta potenza, sia la punta della pipetta che il filamento di lucidatura devono essere a fuoco e nel campo visivo. In caso contrario, regolare l'altezza del filamento. Poiché la posizione della pipetta non può essere regolata, la punta della pipetta e il filamento devono trovarsi sui lati opposti del campo visivo.
Evitare di posizionare la punta della pipetta troppo vicino al filamento perché si espanderà man mano che si riscalda e potrebbe urtare la pipetta. Una volta posizionati correttamente il puntale e il filamento, ruotare la valvola per dirigere l'aria pressurizzata nella pipetta e riscaldare il puntale fino a quando la conicità dietro il puntale inizia a gonfiarsi verso l'esterno. Interrompere il riscaldamento prima che la punta si gonfi troppo.
La sperimentazione è necessaria per determinare la distanza, il calore e il tempo appropriati per la forma desiderata. Come passaggio opzionale, è possibile lucidare la punta anche in assenza di pressione per ridurre il diametro di apertura della punta. Inoltre, tieni presente che questi passaggi di lucidatura possono essere ripetuti con precisione.
Regolare sia la forma che le dimensioni del puntale della pipetta. Al termine della lucidatura. Spegnere il punto di pressione del puntale della pipetta in una direzione sicura.
Rimuovere la pipetta e riporla in una scatola di conservazione pulita dove sarà protetta dalla polvere. Per la sicurezza del laboratorio, assicurarsi di disattivare la pressione prima di rimuovere la pipetta. In caso contrario, può essere espulso dal portapipetta.
Dopo la rimozione, vi abbiamo appena mostrato come lucidare a pressione le pipette per migliorare le registrazioni del patch clamp. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di rivestire la bobina di lucidatura con vetro ad alta temperatura di fusione per ridurre al minimo la deposizione di metallo vaporizzato sulle pipette. E di usare cautela mentre le pipette sono esposte all'aria pressurizzata.
Assicurarsi che la pipetta sia tenuta saldamente nel supporto e di spegnere l'aria prima di rimuovere la pipetta dal supporto. Quindi questo è tutto. Grazie per l'attenzione.
Buona lucidatura a pressione e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questa guida descrive la modifica delle forme delle micropipette di vetro utilizzando calore e pressione dell'aria. Il processo consente di allargare il cono senza aumentare l'apertura della punta, il che è essenziale per ottenere registrazioni a basso rumore in applicazioni su piccole cellule.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Eletrofisiologia
- Fabbricazione di micropipette
Sfondo
- Le micropipette di vetro sono strumenti cruciali nelle registrazioni elettrofisiologiche.
- Una minore resistenza della pipetta è necessaria per registrazioni di alta qualità.
- La modifica della forma può migliorare le prestazioni in varie applicazioni.
- Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per le registrazioni su piccole cellule.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo per modellare le micropipette di vetro.
- Ridurre la resistenza della pipetta senza ingrandire l'apertura della punta.
- Migliorare la qualità delle registrazioni da piccole cellule.
Metodi utilizzati
- Posizionare la punta della pipetta vicino a un filamento lucidante con alta ingrandimento.
- Applicare pressione dell'aria e calore per espandere la punta della pipetta.
- Spegni il calore per ottenere un'apertura della punta più piccola.
- Regolazioni finali spegnendo pressione e calore.
Risultati principali
- La punta della pipetta può essere rimodellata in una forma smussata in modo efficace.
- Si ottiene una resistenza inferiore senza aumentare la dimensione della punta.
- Questo metodo migliora la qualità delle registrazioni da piccole cellule.
- Dimostra un approccio pratico per la modifica delle micropipette.
Conclusioni
- La modellazione delle micropipette di vetro è una tecnica preziosa nella ricerca neuroscientifica.
- Un design della pipetta migliorato porta a una migliore qualità dei dati.
- Questo metodo può essere applicato in vari studi elettrofisiologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Pressure-polishing pipettes reduces electrical resistance in patch-clamp recordings without altering tip diameter, enabling higher-fidelity ion channel measurements from small neuronal populations. This technical improvement supports target validation in neuroscience drug discovery by improving signal-to-noise ratios in electrophysiological assays. Enhanced recording quality increases predictive confidence in early-stage mechanistic studies of neuronal excitability and synaptic function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ion channel function in small-diameter neurons critical for neuropathic pain and epilepsy targets.
- Operational Value: Reduces variability in single-channel recordings by minimizing pipette-induced noise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized pipette geometries for reproducible electrophysiological screening panels.
- Operational Value: Compatible with both soft and hard glass micropipettes, allowing flexible assay design across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports perforated-patch clamp applications by generating blunt tips that increase membrane bleb formation for antibiotic perforants.
- Operational Value: Extends recording duration in primary neuronal cultures, improving throughput for lead optimization studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within early discovery workflows where electrophysiological phenotyping informs target selection and lead compound profiling.
- Discovery Biology: Enables functional validation of ion channel targets in disease-relevant neuronal models.
- Screening: Delivers low-resistance pipettes for high-fidelity compound screening in patch-clamp platforms.
- Analytics: Generates quantitative current and conductance measurements with improved signal stability.
- Translational Research: Facilitates longitudinal recording in acute slices and cultured neurons for pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling.
- Enterprise Reuse: Requires only a microforge upgrade, making it a scalable, low-cost enhancement to existing electrophysiology infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through cleaner electrophysiological phenotypes.
- Operational Value: Improves assay reproducibility across sites and operators by standardizing pipette geometry.
- Strategic Value: Reduces false negatives in ion channel screening by minimizing technical noise.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions in preclinical programs targeting neuronal excitability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micropipette handling and electrophysiology.
- Needs a microforge with high-pressure valve, heating filament, and magnification optics.
- Demands standardization of pressure, heat, and timing parameters across users.
- Must account for glass-type differences (soda lime vs. borosilicate) in polishing response.
- Limited by the need for manual tip positioning and operator skill to avoid over-expansion.
