Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione
22 ottobre 2008
Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.
Questa procedura inizia posizionando la punta della pipetta vicino al filamento di lucidatura con un ingrandimento di 100 volte. Quindi accendi la pressione dell'aria e il calore. Il filamento.
La punta della pipetta si espanderà per formare una punta di forma smussata. Spegnete il fuoco per ottenere un'apertura della punta più piccola. Spegnere la pressione e riscaldare di nuovo.
Ciao, sono Brandon Johnson del laboratorio della dottoressa Miriam Goodman presso il Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford. Oggi vi mostreremo una procedura per le pipette per cerotti con lucidatura a pressione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i canali ionici e i cerotti di membrana e i neuroni NC elgan.
Quindi iniziamo. Estrarre un set da sei a 10 pipette per cerotti. Consulta un esperto locale o il nostro esperimento visualizzato che realizza pipette per patch ed elettrodi affilati con una polare programmabile per assistenza.
Per iniziare la procedura, impostare una pressione dell'aria compressa a circa 40 PS. Quindi collego l'aria compressa a una valvola di controllo a quattro vie. Collegare un pezzo di tubo di plastica alla valvola a quattro vie e collegare un supporto per pipetta ad alta pressione all'estremità libera del tubo di plastica. Utilizzare un impianto di micro forgiatura per eseguire la lucidatura.
Utilizziamo il kit Ccpm two di LA Scientific. Questo banco di perforazione è dotato di un portapipette ad alta pressione, di un filamento riscaldante in platino controllato da un pedale e di un microscopio dotato di un ingrandimento basso e alto di 10 volte in 100 volte di lunghezza. Gli obiettivi ad aria a distanza di lavoro sono ideali perché è fondamentale poter osservare l'apertura della pipetta durante il protocollo.
Quindi, verificare che la valvola di pressione sia in posizione off. Quindi posizionare una pipetta nel supporto della pipetta e serrare il raccordo a mano per la sicurezza del laboratorio. Assicurarsi che la pipetta sia tenuta saldamente nel portapipetta.
In caso contrario, la pressione dell'aria causerà l'espulsione della pipetta dal supporto. Come passaggio facoltativo, è possibile rivestire la pipetta con un isolante idrofobico come la cera per ridurre la capacità e migliorare le caratteristiche di rumore. Posizionare ora la pipetta nel supporto nella microforgia, posizionare il supporto della pipetta sul tavolino del microscopio in modo che sia la punta che il filamento di lucidatura siano visibili a una potenza bassa di 10 volte sulla microforgia.
Portare la punta a circa 50 micron dal filamento, quindi passare all'obiettivo 100 ad alta potenza, sia la punta della pipetta che il filamento di lucidatura devono essere a fuoco e nel campo visivo. In caso contrario, regolare l'altezza del filamento. Poiché la posizione della pipetta non può essere regolata, la punta della pipetta e il filamento devono trovarsi sui lati opposti del campo visivo.
Evitare di posizionare la punta della pipetta troppo vicino al filamento perché si espanderà man mano che si riscalda e potrebbe urtare la pipetta. Una volta posizionati correttamente il puntale e il filamento, ruotare la valvola per dirigere l'aria pressurizzata nella pipetta e riscaldare il puntale fino a quando la conicità dietro il puntale inizia a gonfiarsi verso l'esterno. Interrompere il riscaldamento prima che la punta si gonfi troppo.
La sperimentazione è necessaria per determinare la distanza, il calore e il tempo appropriati per la forma desiderata. Come passaggio opzionale, è possibile lucidare la punta anche in assenza di pressione per ridurre il diametro di apertura della punta. Inoltre, tieni presente che questi passaggi di lucidatura possono essere ripetuti con precisione.
Regolare sia la forma che le dimensioni del puntale della pipetta. Al termine della lucidatura. Spegnere il punto di pressione del puntale della pipetta in una direzione sicura.
Rimuovere la pipetta e riporla in una scatola di conservazione pulita dove sarà protetta dalla polvere. Per la sicurezza del laboratorio, assicurarsi di disattivare la pressione prima di rimuovere la pipetta. In caso contrario, può essere espulso dal portapipetta.
Dopo la rimozione, vi abbiamo appena mostrato come lucidare a pressione le pipette per migliorare le registrazioni del patch clamp. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di rivestire la bobina di lucidatura con vetro ad alta temperatura di fusione per ridurre al minimo la deposizione di metallo vaporizzato sulle pipette. E di usare cautela mentre le pipette sono esposte all'aria pressurizzata.
Assicurarsi che la pipetta sia tenuta saldamente nel supporto e di spegnere l'aria prima di rimuovere la pipetta dal supporto. Quindi questo è tutto. Grazie per l'attenzione.
Buona lucidatura a pressione e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questa guida descrive la modifica della forma delle micropipette di vetro mediante l'uso di calore e pressione d'aria. Il processo permette di allargare la zona conica senza aumentare l'apertura della punta, condizione essenziale per ottenere registrazioni a basso rumore in applicazioni su cellule di piccole dimensioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Preparazione di micropipette
Sfondo
- Le micropipette di vetro sono strumenti fondamentali nelle registrazioni elettrofisiologiche.
- Una resistenza della pipetta più bassa è necessaria per registrazioni di alta qualità.
- La modifica della forma può migliorare le prestazioni in diverse applicazioni.
- Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per le registrazioni da cellule piccole.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo per modellare micropipette di vetro.
- Ridurre la resistenza della pipetta senza aumentare l'apertura della punta.
- Migliorare la qualità delle registrazioni ottenute da cellule piccole.
Metodi Utilizzati
- Posizionare la punta della pipetta vicino a un filamento abrasivo ad alta ingrandimento.
- Applicare pressione d'aria e calore per espandere la punta della pipetta.
- Spegnere il riscaldamento per ottenere un'apertura più piccola della punta.
- Regolazioni finali spegnendo pressione e calore.
Risultati principali
- La punta della pipetta può essere rimodellata efficacemente in una forma arrotondata.
- Si ottiene una resistenza inferiore senza aumentare le dimensioni della punta.
- Questo metodo migliora la qualità della registrazione da cellule piccole.
- Illustra un approccio pratico per la modifica di micropipette.
Conclusioni
- La modellatura di micropipette di vetro è una tecnica preziosa nella ricerca neuroscientifica.
- Un design migliore delle pipette porta a una qualità superiore dei dati.
- Questo metodo può essere applicato in vari studi elettrofisiologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La lucidatura a pressione delle pipette riduce la resistenza elettrica nelle registrazioni con tecnica del patch-clamp senza alterare il diametro della punta, consentendo misurazioni più accurate dei canali ionici in popolazioni neuronali di piccole dimensioni. Questo miglioramento tecnico supporta la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci in neuroscienze, migliorando i rapporti segnale-rumore nei saggi elettrofisiologici. Una qualità superiore delle registrazioni aumenta l'affidabilità predittiva negli studi meccanicistici precoci dell'eccitabilità neuronale e della funzione sinaptica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione dei canali ionici in neuroni di piccolo diametro, fondamentali per lo studio del dolore neuropatico e dei bersagli dell'epilessia.
- Valore operativo: Riduce la variabilità delle registrazioni di singoli canali minimizzando il rumore indotto dalla pipetta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce geometrie di pipetta standardizzate per pannelli di screening elettrofisiologici riproducibili.
- Valore operativo: Compatibile sia con micropipette in vetro morbido che in vetro duro, consentendo una progettazione flessibile dei saggi su diverse classi di bersagli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta le applicazioni della tecnica del perforated-patch clamp generando punte arrotondate che aumentano la formazione di bleb della membrana per perforanti antibiotici.
- Valore operativo: Estende la durata della registrazione in colture primarie di neuroni, migliorando la produttività per studi di ottimizzazione dei composti promettenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nei flussi di lavoro di scoperta precoce in cui il fenotipaggio elettrofisiologico orienta la selezione del bersaglio e il profilo dei composti attivi.
- Biologia della scoperta: Permette la validazione funzionale di bersagli canali ionici in modelli neuronali rilevanti per la malattia.
- Screening: Fornisce pipette a bassa resistenza per screening di composti ad alta fedeltà in piattaforme di patch-clamp.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative delle correnti e della conduttanza con stabilità del segnale migliorata.
- Ricerca traslazionale: Consente registrazioni longitudinali in fette acute e neuroni coltivati per la modellizzazione farmacocinetica-farmacodinamica.
- Riutilizzo aziendale: Richiede soltanto un aggiornamento del microforgiatore, rappresentando così un miglioramento scalabile ed economico dell'infrastruttura elettrofisiologica esistente.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi attraverso fenotipi elettrofisiologici più puliti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità del saggio tra diversi siti e operatori standardizzando la geometria delle pipette.
- Valore strategico: Riduce i falsi negativi nel screening dei canali ionici minimizzando il rumore tecnico.
- Impatto sul portafoglio: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi preclinici mirati all'eccitabilità neuronale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della micropipetta e nell'elettrofisiologia.
- Necessita di un microforgiatore dotato di valvola ad alta pressione, filamento riscaldante e ottiche di ingrandimento.
- Esige la standardizzazione dei parametri di pressione, calore e tempistica tra diversi utilizzatori.
- Deve tenere conto delle differenze nel tipo di vetro (calco-sodico rispetto a borosilicato) nella risposta alla lucidatura.
- È limitato dalla necessità di posizionare manualmente la punta e dall'abilità dell'operatore nel prevenire un'eccessiva espansione.
