Name: 熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学ぶHsp70シャペロン機能の大腸菌ベース相補アッセイ。機能的Hsp70を導入し、熱ストレス下での成長回復を評価することで、細胞保護における分子シャペロンの役割を解明します。

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この研究は、国際遺伝子工学バイオテクノロジーセンター(ICGEB)の助成金番号(HDI/CRP/012)、ヴェンダ大学研究局、科学イノベーション省(DSI)の助成金I595、南アフリカ国立研究財団(NRF)(助成金番号75464および92598)からASに授与された助成金によって支援されました。

1. トランスフォーメーション
注:培養には滅菌ガラス器具、ピペットチップ、および調製したてのオートクレーブ滅菌した培地を使用してください。2x酵母トリプトン(YT)[1.6%トリプトン(w/v)、1%酵母抽出物(w/v)、0.5%NaCl(w/v)、1.5%寒天(w/v)]寒天培地で大 腸菌 細胞の培養を調製します。プロトコルで使用される一般的な試薬とその供給源は、 材料表に記載されています。
<ol><li>2.0 mLの微量遠心チューブに標識し、50 μLのコンピテント 大腸菌dnaK756細胞を分注し、細胞を氷上に保持します。</li>
	<li>コンピテントセルを含む2.0 mL微量遠心チューブに、10〜50 ngのpQE60/DnaK、pQE60/KPf、およびpQE60/KPf-V436FプラスミドDNA9を別々のチューブに分注します。</li>
	<li>コンピテントセルとプラスミドDNAを含む2.0 mL微量遠心チューブを氷上に30分間保持します。</li>
	<li>コンピテント細胞とDNAの混合物を42°Cで60秒間熱ショックし、微量遠心チューブを氷上に10分間戻します。</li>
	<li>950 μLの新鮮な2x YTブロス(37°Cでプレインキュベート)を加え、150回転/分で1時間振とうしながら37°Cでインキュベートします。必要に応じて、細胞の回復を促進するために、細胞をはるかに長く成長させたままにします。 注:セルを激しく振ることは避けてください。</li>
	<li>細胞100 μLをピペットで移し、プラスミド選択用に50 μg/mLのカナマイシン、10 μg/mLのテトラサイクリン、およびプラスミド選択用の100 μg/mLのアンピシリン( 材料表を参照)を含む2x YT寒天プレートに広げます。</li>
	<li>残りの細胞(容量は約900 μL)をベンチトップ微量遠心分離機を使用して、5000 x g (4°C)で1分間遠心分離します。</li>
	<li>約800 μLのブロスをデカントし、残りの培地を使用してペレット化した細胞を再懸濁します。</li>
	<li>回収した細胞を2x YT寒天プレートに播種します。</li>
	<li>両方の寒天プレートを37°Cで一晩(または約17時間)インキュベートします。 注:これらの細胞は非常にゆっくりと成長し、より長い時間インキュベートする必要がある場合があります。非常に小さいコロニーを見つけるように注意してください。遠心分離(ステップ1.7)後に再懸濁した細胞を含むプレートは、細胞の形質転換効率が悪い場合のバックアップとして機能し、その場合、ペレット化した細胞は形質転換細胞の回収率を向上させる可能性があります。しかし、形質転換効率が優れていれば、濃縮細胞をプレーティングした寒天プレートは、インキュベーション時に培養物が生い茂り、単一コロニーの同定が困難になることがあります。その場合、もう一方の寒天プレートは、間隔の広いコロニーが成長するプレートである可能性があります。</li>
</ol>2. 細胞プレーティング
<ol><li>形質転換体から単一のコロニーをピックアップし、50 μg/mL のカナマイシン、大 腸菌 dnaK756 細胞の選択のために 10 μg/mL のテトラサイクリン、プラスミドの選択のために 100 μg/mL のアンピシリンを添加した 10 mL の 2x YT ブロスに接種します。 注:フラスコ(≥50 mL)を使用して、培養物を攪拌するときは必ず通気してください。接種物を37°Cで一晩(17時間)インキュベートし、150回転/分で振とうします。</li>
	<li>翌朝、OD600で吸光度を読み取ります。</li>
	<li>75%エタノールを使用して作業台の表面を洗浄し、細胞のスポッティングに備えて表面を綿棒で拭きます。</li>
	<li>2 mLの微量遠心チューブを使用し、2x YTブロスを使用して培養液をOD600読み取り値2.0に標準化します。 注:このステップは、さまざまなサンプルの細胞密度を標準化するために重要であるため、ODの読み取り値が正しく取得されていることを確認してください。</li>
	<li>2 mLの微量遠心チューブを使用して、細胞を100から10-5までの段階希釈液を調製します。</li>
	<li>細胞のスポットに使用する寒天プレートを40°Cに設定したオーブンでインキュベートし、水蒸気を確実に逃がすために蓋を部分的に開いた状態でプレートを乾燥させます。 注:細胞が均一に分離された距離で斑点が見られるようにするには、斑点部位のテンプレートが印刷された紙に線を引きます。</li>
	<li>50 μg/mLのカナマイシン、10 μg/mLのテトラサイクリン、100 μg/mLのアンピシリン、および0.5 mM IPTG(組換えタンパク質の発現誘導用)を添加した寒天プレート上に、段階希釈した細胞2 μLをスポットします( 材料表を参照)。</li>
	<li>各サンプルを2つの別々のプレート(1つは37°Cでインキュベート、もう1つは43.5°C)にスポットします。 注:寒天プレートに穴を開けないでください。</li>
	<li>環境への影響を最小限に抑えるために、実験サンプルと同じプレートにサンプルをスポットコントロールします。</li>
	<li>スポッティングを迅速に行い、細胞が成長し始める前にプロセスが完了していることを確認してください。 注:エアロゾルはプレートを汚染するため、スポッティング時には避けることが重要です。また、汚染を避けるために、スポッティングの間にプレートを閉じておくことも重要です。</li>
	<li>一方のプレートを37°C(許容増殖温度)でインキュベートし、もう一方のプレートを非許容増殖温度43.5°Cでインキュベートします。 注:凝縮水が斑点のあるコロニーをその位置から洗い流すため、蒸気が蓋に溜まらないように、プレートを逆さまにしてインキュベートします。</li>
	<li>すべてのプレートをインキュベーターに同時に置き、翌朝までインキュベーターを開かないようにします。 注:プレートのインキュベーション中にインキュベーターのドアを数回開くことはお勧めしません。これは、インキュベーターに空気が入ると、細胞増殖に悪影響を与える温度変動が生じる可能性があるためです。</li>
</ol>3. 組換えタンパク質の発現確認
<ol><li>滅菌ループを使用して、形質転換大 腸菌dnaK756細胞の同じコロニーから残りの細胞の一部をピックアップします。</li>
	<li>50 μg/mL のカナマイシン、10 μg/mL のテトラサイクリン、および 100 μg/mL のアンピシリンを添加した 10 mL の YT ブロスに細胞を接種します。37°Cで150回転/分で振とうしながら一晩(17時間)インキュベートします。</li>
	<li>ステップ3.2で説明したように、必要な抗生物質を含む90 mLの滅菌2x YTブロスに培養液を移します。細胞を対数期中期(OD600 = 0.4-0.6)まで成長させます。</li>
	<li>誘導前に2 mLのサンプル培養液を採取します(0時間誘導サンプル)。</li>
	<li>IPTGを最終濃度1 mMに添加してタンパク質産生を誘導し、細胞を37°Cで再インキュベートします。</li>
	<li>誘導の 6 時間後に 2 回目の 2 mL サンプルを採取します。</li>
	<li>5000 x g で10分間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離機の温度を4°Cに保ちます。</li>
	<li>上澄みを捨てます。</li>
	<li>ペレットをPBS緩衝液(137 mM NaCl、27 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4、1.4 mM KH2PO4)に再懸濁し、-20°Cで保存します。</li>
</ol>4. SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析
<ol><li>前述のように2x 10%SDSゲルを調製します19.</li>
	<li>SDS-PAGEゲルの1つを保管し、その後のCoomassie染色試薬でタンパク質バンドを観察するために染色します。2つ目のSDS-PAGEゲルを使用して、ウェスタンブロット解析を行います。</li>
	<li>再懸濁したサンプル80 μLを分注し、20 μLの4x Laemmli SDSローディングバッファーと混合します。</li>
	<li>懸濁液を100°Cで10分間沸騰させます。次に、各サンプル10 μLをプレキャストSDSゲルにロードします( 材料表を参照)。</li>
	<li>SDS ランニングバッファー(25 mm トリス、250 mm グリシン、0.1% (w/v) SDS)の 1 倍溶液中で 120 V の電圧を使用して、室温で 1 時間電気泳動を行います。</li>
	<li>ゲルをクマシー染色( 材料表を参照)で1時間染色し、続いて脱染バッファー(蒸留水に50%(v/v)メタノール、10%(v/v)酢酸)を使用して2時間脱色します。</li>
	<li>ゲルイメージングシステムを使用して、ゲル中に存在するタンパク質バンドを可視化します( 材料表を参照)。上記のプロトコルに従って、同じサンプルで別のSDS-PAGEゲルを再泳動します。</li>
	<li>電気泳動分析が終了したら、SDS-PAGEゲルを服用して、前述のようにウェスタンブロット分析を実施します19。</li>
	<li>タンパク質を転写したニトロセルロースメンブレンを洗浄バッファー(TBS-Tween、pH 7.4 [50 mM Tris、150 mM NaCl、1%(v/v)Tween])で洗浄します。</li>
	<li>α-DnaK( 材料表参照)を用いてDnaKを、KPf及びその変異体KPf-V436Fの検出にα-PfHsp70-17)をそれぞれ用いる。</li>
	<li>抗体は、5%脱脂乳中で1:2000に希釈して使用します。4°Cで60回転/分で1時間振とうしながらインキュベートします。</li>
	<li>TBS-Tweenでニトロセルロースメンブレンを15分間に3回洗浄することにより、非特異的結合抗体を除去します。</li>
	<li>メンブレンを二次抗体(α-ウサギ、 材料表を参照)で前のステップと同じ条件でインキュベートします。その後、一次抗体と同じ条件で洗浄します。</li>
	<li>増強化学発光(ECL)検出試薬を使用してバンドを分離します。</li>
	<li>ゲルイメージャーを使用してバンドを可視化します。</li>
</ol>

大腸菌 dnaK756細胞を用いたHsp70シャペロン活性の評価

<ol><li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li>
<li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodial+heat+shock+proteins%3A+targets+for+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li>
<li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins%3A+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li>
<li>Edkins, A. L., Boshoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).</li>
<li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+%28DnaK%29+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li>
<li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li>
<li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li>
<li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li>
<li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626(2016).</li>
<li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bact%22%5BJournal%5D)">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li>
<li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243(2015).</li>
<li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+%28C62.+5%29+in+response+to+nutritional+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bact%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li>
<li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li>
<li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bacterial+gene+%28groP+C%29+which+affects+%CE%BB+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li>
<li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li>
<li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li>
<li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Eng+Res%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li>
<li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li>
<li>Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007).</li>
<li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226(2021).</li>
<li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins%3A+Expanding+the+chaperone+code%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li>
<li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389(2019).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反を持っていません。

プロトコルは異種に表現されたHsp70のシャペロン機能の調査の エシェリヒア属大腸菌dnaK756セルの有用性を示す。このアッセイは、 セルロのHsp70機能を標的とする阻害剤のスクリーニングに採用できます。ただし、この方法の1つの制限は、 大腸菌 のDnaKを代替できないHsp70がこのアッセイに適合しないことです。一部の非天然Hsp70の翻訳後修飾21の欠如は、 大腸菌 系内での機能の欠如を説明する可能性がある。酵母ベースの相補アッセイ22は、 大腸菌ベースのアッセイのいくつかの欠点に対処し得る。
再現性のある結果を得るためには、いくつかの重要なステップが重要です。これらには、それぞれのプラスミドコンストラクトによって形質転換された細胞のみがプレーティング中に使用されるようにすることが含まれます。さらに、ステップ全体を通して培養物の汚染を避けることが重要です。さらに、ストレスを受けた 大腸菌 DnaK細胞は過剰なフィラメント化の影響を受けやすいため10、この物理的緊張が広範なフィラメント形成を促進するため、培養中の激しい揺れを避けることが重要です。過度にフィラメント化された細胞は、OD600でより高い偽の見かけの成長測定値を与え、培養増殖の過大評価につながり、プレーティング前の細胞の標準化に悪影響を及ぼします。Hsp70は通常の条件下では 大腸菌 の増殖に必須ではないが、このタンパク質を欠損した細胞はストレスを受けやすい10。このため、 大腸菌dnaK756細胞は、形質転換後、またはグリセロールストックからの回収中に、はるかにゆっくりと増殖します。さらに、温度変動に非常に敏感です。したがって、メッキされた寒天プレートを内部に置いたら、プレートを表示する時間になるまで、インキュベーターのドアを開かないようにすることが重要です。
ウェスタンブロットデータは、 大腸菌dnaK756細胞におけるそれぞれの組換えHsp70タンパク質の発現を確認するために重要です。それぞれのタンパク質の発現に失敗すると、非許容増殖温度で増殖する細胞の偽陰性の結果につながります。

熱ショックタンパク質は、タンパク質のフォールディングを促進し、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質のミスフォールディングを逆転させることにより、分子シャペロンとして重要な役割を果たします1,2。熱ショックプロテイン70(Hsp70)は、タンパク質の恒常性において中心的な役割を果たす、最も著名な分子シャペロンの一つである3,4。DnaKは大腸菌Hsp70の相同体5である。
Hsp70のシャペロン活性を探り、このシャペロンを標的とする阻害剤をスクリーニングするために、さまざまな生物物理学的、生化学的、および細胞ベースのアッセイが開発されています6,7,8。Hsp70は高度に保存されたタンパク質です。このため、熱帯熱マラリア原虫(マラリアの主媒)などの真核生物のHsp70が、大腸菌のDnaK機能を代替することが報告されています6,9。このようにして、大腸菌におけるHsp70の異種発現を含む大腸菌ベースの相補アッセイが開発され、その細胞保護機能が探索されました。典型的には、このアッセイでは、DnaKが欠損している、または機能的に損なわれている天然DnaKを発現する大腸菌細胞の利用を伴います。DnaKは、通常の条件下では大腸菌の増殖に必須ではありませんが、細胞が高温やその他の形態のストレスなどのストレスの多い条件下で増殖すると不可欠になります10,11。
相補アッセイを用いてHsp70の機能を研究するために開発された大腸菌株には、大腸菌dnaK103(BB2393 [C600 dnaK103(Am)thr::Tn10])および大腸菌dnaK756が含まれます。大腸菌dnaK103細胞は、機能しない切断型DnaKを産生するため、細胞は30°Cで十分に増殖するが、菌株は寒さや熱ストレスに敏感である12,13。同様に、大腸菌dnaK756 / BB2362(dnaK756 recA :: TcR Pdm1,1)株は40°C以上では増殖しません14,15。大腸菌dnaK756株は、32位、455位、および468位で3つのグリシンからアスパラギン酸への置換を特徴とする変異体ネイティブDnaK(DnaK756)を発現し、タンパク質抑制の結果が損なわれます。その結果、この菌株はバクテリオファージλDNAに耐性である14。さらに、大腸菌dnaK756はATPアーゼ活性の上昇を示すが、ヌクレオチド交換因子であるGrpEに対する親和性は低下する16。大腸菌DnaK変異株は、相補的アプローチによってHsp70のシャペロン活性を調べるための理想的なモデルとなります。DnaKはストレスの多い条件下でのみ必須であるため、相補アッセイは通常、高温で実施されます(図1)。この研究に大腸菌を使用する利点には、そのよく特徴付けられたゲノム、急速な成長、および培養と維持の低コストが含まれます17。
この記事では、Hsp70の機能を研究するために大腸菌dnaK756細胞を使用するプロトコルについて詳しく説明します。今回使用したHsp70は、野生型DnaKとそのキメラ誘導体KPf(熱帯熱マラリア原虫Hsp70-1のC末端基質結合ドメインにDnaKのATPaseドメインが融合したもの)である6,18。KPf-V436Fは、変異が基質への結合を本質的にブロックし、シャペロン活性を阻害するため、ネガティブコントロールとして異種的に発現した9。

<table><tbody><tr><td>2-&β;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8,05,740</td><td>サンプルローディング染料の成分</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Labchem</td><td>101005125</td><td>脱染剤の成分</td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8008300100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>の成分 寒天</td><td>メルク</td><td>HG000BX1.500</td><td>中・液体成長アッセイの成分</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>賢い科学</td><td>14131031</td><td>認定分子生物学 アガロー</td></tr>ス <tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101875295</td><td>SDS-PAGEゲルの成分</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>VWR International</td><td>0339 & EU&mdash;25G</td><td>選択的抗生物質</td></tr><tr><td>ビス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>1015460100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>ブロモフェノール</td>の成分 <td>シグマアルドリッチ</td><td>0449-25G</td><td>サンプルローディング染料</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>コンピテントセル調製用</td></tr><tr><td>クーマシーブリリアントブルーVWR</td><td>インターナショナル</td><td>443293X</td><td>SDS-PAGE色素</td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB10368</td><td>PBSバッファーの成分</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>32109</td><td>ウェスタンブロット検出試薬</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>17898</td><td>DNAインターカレート色素</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>メルク</td><td>SAAR2676520L</td><td>サンプルローディング色素の成分</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>VWRインターナショナル</td><td>10119CU</td><td>SDS</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>の成分 グレンサムライフサイエンス</td><td>162IL</td><td>誘導剤</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>メルフォード</td><td>K0126</td><td>選択的抗生物質</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>メルク</td><td>SAAR4123000EM</td><td>中および液体成長アッセイの成分</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Labchem</td><td>113140129</td><td>脱染剤</td></tr><tr>の成分<td>一塩基性リン酸カリウム</td><td>メルク</td><td>1,04,87,30,250</td><td>PBS緩衝液の成分</td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>メルク</td><td>HG000BX4.250</td><td>中・液体成長アッセイの成分</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>SAAR5042020EM</td><td>PBS緩衝液の成分</td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PB7320</td><td>ウェスタンブロット膜</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>SAAR5822320EM</td><td>中・液成長アッセイの成分</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>VWRインターナショナル</td><td>108073</td><td>発現タンパク質の分解に</td></tr><tr><td>Spectramax iD3</td><td>セパレーション</td><td>373705019</td><td>自動プレートリーダー</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>VWR インターナショナル</td><td>ACRO420580500</td><td>SDSゲルの成分</td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>デュチェファ バイオケミーズ</td><td>T0150.0025</td><td>選択的抗生物質</td></tr><tr><td>トリス</td><td>VWRインターナショナル</td><td>19A094101SDS</td><td>ゲルの成分</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>メルク</td><td>SAAR3164500XF</td><td>ウエスタンウォッシュバッファーの成分</td></tr><tr>ウ<td>エスタントランスファーチャンバー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PB0112</td><td>ニトロセルロース膜酵母</td></tr><tr><td>抽出物</td><td>メルク</td><td>HG000BX6.500</td><td>へのタンパク質の転写中液成長アッセイの成分</td></tr><tr><td>&-DnaK抗体</td><td>Inqaba</td><td>BK CAC09317</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>&-ウサギ抗体</td><td>Thermofischer scientific</td><td>31460</td><td>二次抗体</td></tr></tbody></table>

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

ヒートショックプロテイン70(Hsp70)は、細胞内の他のタンパク質のフォールディングを促進する保存されたタンパク質であり、分子シャペロンになります。Hsp70は、通常の条件下で増殖する 大腸菌 細胞には必須ではありませんが、高温での増殖にはこのシャペロンが不可欠です。Hsp70は高度に保存されているため、様々な種の Hsp70遺伝子のシャペロン機能を研究する1つの方法は、Hsp70が欠損している大腸菌株または機能的に損なわれた天然のHsp70を発現している大 腸菌 株でそれらを異種的に発現させることです。 大腸菌dnaK756細胞はλバクテリオファージDNAを支持できません。さらに、天然のHsp70(DnaK)は、GrpE(Hsp70ヌクレオチド交換因子)に対する親和性が低下する一方で、ATPアーゼ活性の上昇を示します。その結果、 大腸菌dnaK756細胞は30°Cから37°Cの範囲の温度で十分に増殖しますが、高温(>40°C)では死滅します。このため、これらの細胞はHsp70のシャペロン活性を研究するためのモデルとして機能します。ここでは、これらの細胞を相補アッセイに適用し、Hsp70の セルロシャ ペロン機能の研究を可能にする詳細なプロトコルについて説明します。

図2は、それぞれ37°Cおよび43.5°Cの許容増殖温度でスポットおよび培養された細胞を含むスキャン寒天の画像を示しています。図2の右側は、大腸菌dnaK756細胞におけるDnaK、KPf、およびKPf-V436Fの発現を切除したウェスタンブロット成分です。予想通り、37°Cの許容増殖温度で培養したすべての大腸菌dnaK756細胞はなんとか増殖することができました。しかし、43.5°Cの非許容増殖条件下では、以前に報告されたように、DnaKとKPfを異種的に発現する細胞のみが増殖することができました6,9,20(図2)。一方、KPf-V436Fを発現する細胞は、37°Cでは増殖し、43.5°Cでは増殖しませんでした。 これは、DnaKとKPfが熱ストレス条件下で大腸菌dnaK756細胞の増殖欠陥を回復できたことを示しています。KPf-V436Fを異種的に発現する細胞が43.5°Cでの細胞増殖をサポートできないことは、このタンパク質のシャペロン機能の欠如を示しています。この点で、KPf-V436Fは理想的なネガティブコントロールタンパク質として機能します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66515/66515fig01.jpg"> 図1:異種発現タンパク質のシャペロン機能を研究するための 大腸菌dnaK756 細胞を用いた相補アッセイの原理。 大腸菌dnaK756は、熱ストレスから細胞を保護することができない天然のDnaK756タンパク質を発現します。機能的異種Hsp70の導入は、熱ストレスにさらされると細胞を死から救う。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66515/66515fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66515/66515fig02.jpg"> 図2:大 腸菌dnaK756細胞を熱ストレスから保護するDnaKおよびKPfの能力を実証する相補プレートアッセイ。 形質転換細胞を37°C(許容増殖温度)および43.5°C(非許容増殖温度)で培養した。細胞を標準化し、段階希釈液として播種しました。「N」は「Neat」を象徴し、希釈されていない細胞で構成された最初のスポットを表します。右端は、3つのタンパク質の発現を表すウェスタンブロット切除です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66515/66515fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは熱衝撃蛋白質70 (Hsp70)のシャペロンの活動を示す。 大腸菌dnaK756 細胞は、天然の機能障害Hsp70を保有し、熱ストレスの影響を受けやすいため、アッセイのモデルとなります。機能的なHsp70の異種導入は、細胞の成長欠乏を救います。

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

私は、マラリアや結核などのヒト感染症を引き起こす抗原に将来の静電気防御を付与する熱ショックタンパク質の役割を研究しています。私の研究は基本的に、ヒトに感染する病原体の熱ショックタンパク質機構の構造と機能的特徴に焦点を当てています。熱中症蛋白質は一般的に高度な概念を持っていますが、ある程度の機能的特殊化を示します。さらに、それらは薬剤耐性に関与しています。そのため、さまざまな疾患モデルにおいて薬剤耐性を逆転させるために、それらを標的とする取り組みが進行中です。それらには、生化学的、生物物理学的、バイオインフォマティクス、および細胞生物学的技術が含まれます。言い換えれば、これらのタンパク質の役割を研究するために、さまざまな分野の技術が使用されています。私たちの場合、マラリア原虫のタンパク質の研究はマラリアの主な原因であり、それらは生産が困難であり、これはこれらのタンパク質を研究する能力を制限します。例えば、タンパク質を結晶化して画像化するのに十分なレベルを生成することは困難です。我々は、マラリア原虫におけるこれらのタンパク質の機能的ネットワークのいくつかを確立しました。また、マラリアや結核の原因となる病原体において、これらのタンパク質を標的とする化合物を研究するためのアッセイも確立しました。現在のプロトコルは、モデルとして等しいを使用して、HSP 70のシャペロンタンパク質フォールディングの役割と細胞保護機能を調査するために使用されます。このプロトコルは、タンパク質70を標的とする低分子阻害剤のスクリーニングにも採用できます。

escherichia-coli-based-complementation-assay-to-study-chaperone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。...

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出典: Dahl, J. ほか。 大 腸菌 シャペロンHdeBのpH依存活性の検出 in vitro および in vivo。 J. Vis. Exp.

モデルタンパク質の熱展開による細菌シャペロン活性の評価

出典:Dahl, J.ら。大腸菌シャペロンHdeBのpH依存活性の検出 in vitroおよびin vivo。J. Vis. Exp.(2016年)このビデオは、組換え大 腸菌...

酸ストレス下の 大腸菌 における酸活性化シャペロンの保護的役割の評価

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載...

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。...

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

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最近、タンパク質のミスフォールディングとタンパク質の静止を研究するシステムとして、社会性アメーバDictyostelium discoideumが確立されました。ここでは、D.

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ここでは、分子レベルでRT-qPCRを使用したカエノハブディティス・エレガンスにおける熱ショック応答(HSR)の誘導、細胞レベルの蛍光レポーター、および生物レベルでの熱回収の誘導を評価するために標準化されたプロトコルが提示される。...

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カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

このプロトコルは、グルタチオン結合ドナービーズとGST融合TPR-モチーフコシャペロンおよびアクセプタービーズとHsp90由来ペプチドを結合してタンパク質とタンパク質相互作用を調べるための技術を提示する。この技術を用いて、Hsp90-FKBP51またはHsp90-FkbP52相互作用を破壊する小分子をスクリーニングし、強力で選択的なHsp90-FKBP51相互作用阻害剤を同定しました。...

均質ビーズベースアッセイを用いたシャペロンコカペロン相互作用の研究

学ぶHsp70シャペロン機能の大腸菌ベース相補アッセイ。機能的Hsp70を導入し、熱ストレス下での成長回復を評価することで、細胞保護における分子シャペロンの役割を解明します。

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

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