ルミノールの合成

出典:Lara Al Hariri氏とAhmed Basabrain氏(米国マサチューセッツ州アマースト校

1. 3-ニトロフタルヒドラジドの合成Expand

   このラボでは、3-アミノフタルヒドラジド(ルミノールとも呼ばれる)を 2 ステップのプロセスで合成します。最初のステップは、3-ニトロフタル酸とヒドラジンとの間の縮合反応です。

   このステップでは、カルボン酸基がNH基で置換され、3-ニトロフタルヒドラジドと2つの水分子が生成されます。このラボでは、反応によって有毒な蒸気やガスが発生するため、ヒュームフード内で作業する必要があります。

   • 始める前に、白衣、防滴安全メガネ、ニトリル手袋を着用してください。手記：ヒドラジンは非常に有毒で可燃性であるため、ヒドラジンを含むものはヒュームフード間で輸送するときは、触れないようにし、ヒドラジンを含むものを閉じたり蓋をしたりしてください。
   • 次に、10mLの脱イオン水を測定し、25mLの三角フラスコに注ぎます。cl フラスコをホットプレートに置き、温度計をその中に置きます。
   • 次に、水を加熱し始めます。水温は80°Cにしたいので、ホットプレートの設定を少し高めに設定してください。
   • 加熱しながら、実験室のスタンドに固定されたクランプの下にブンゼンバーナーを設置してください。
   • 25mLの試験管を入手し、炎から約5〜7cm上に試験管を保持するようにクランプを調整します。その後、試験管を取り外し、400mLビーカーに入れます。
   • 水が80°Cに達したら、温度を安定させるために熱設定を調整してください。
   • 次に、風袋引きされた計量ボートで0.6gの3-ニトロフタル酸を計量します。3-ニトロフタル酸を試験管に注ぎます。次に、試験管と試験管ストッパーを溶剤フードに持って行きます。
   • 付属の容量ピペットを使用して、10%v/vのヒドラジン溶液0.9mLを慎重に測定し、試験管に移します。フードに戻る前に、ヒドラジン溶液のボトルに蓋をし、試験管を栓することを忘れないでください。
   • 試験管をブンゼンバーナーにクランプし、ストッパーを取り外します。次に、~2 mL のトリエチレングリコールをメスシリンダーに注ぎ、フードの邪魔にならないようにセットします。
   • さて、試験管に沸騰するチップを2つまたは3つ追加します。試験管に高温温度計を置き、ブンゼンバーナーに点火します。3-ニトロフタル酸が溶解するまで、混合物を中火で加熱します。
   • 次に、トリエチレングリコールを加えて炎の熱を上げます。手記：ヒドラジン溶液からの水が沸騰すると、温度は上昇し続けます。
   • 反応混合物が210°Cに達したら、火を弱め、混合物を210°Cから220°Cの間に3〜4分間保ちます。
   • 次に、炎を消し、混合物が100°Cに冷えるのを待ちます。
   • ホットプレートの電源を切り、温度計を取り外し、フラスコのクランプを外します。トングを使用してフラスコを保持し、メスシリンダーで8mLのお湯を測定します。このお湯を試験管に注ぎ、温度計を取り外します。
   • プラスチックパラフィンフィルムを入手し、試験管の口を覆います。次に、トングを使用して試験管を保持ビーカーに移します。
   • 実験室の流し台では、試験管を水道水に流して冷却し、水が入らないように注意してください。
   • 次に、チューブの外側を乾かしてフードに戻します。cl チューブを直立させ、パラフィンフィルムをはがします。黄色の3-ニトロフタルヒドラジドをチューブ内で15分間沈殿させます。
   • 待っている間に、25mLの三角フラスコに~10mLの脱イオン水を加えてください。250mLのビーカーに氷浴を用意し、その中の水を冷やし始めます。
   • 次に、250mLのフィルターフラスコ、ビュヒナー漏斗、および円形の濾紙を使用して真空ろ過の準備をします。
   • 製品が少なくとも15分間沈殿したら、パスツールピペットを入手し、濾紙を数滴の冷水で濡らします。
   • 次に、真空をオンにし、試験管の内容物をビュヒナー漏斗に注ぎます。残りの固体を1〜2mLの冷水で漏斗にすすぎます。
   • 沸騰したチップをピンセットで取り除き、数滴の冷水ですすいで製品の収集を完了します。
   • 漏斗からフラスコに液体が滴り落ちなくなったら、真空ポンプの電源を切ります。
2. 3-アミノプタルヒドラジドの合成Expand

   ルミノール合成の 2 番目のステップでは、NaOH の塩基性溶液中のジチオン酸ナトリウムを使用して、3-ニトロフタルヒドラジドのニトロ基を還元します。これにより、3-アミノフタルヒドラジドジアニオンが生成されます。

   還元後、酢酸を加えてジアニオンをプロトン化し、ルミノールを形成します。ジチオナイトナトリウムは反応性が高く、すぐに分解するため、わずかに過剰に使用します。還元後、ルミノールジアニオンをプロトン化して、水への溶解度を低下させます。最後に、ルミノールを沈殿させて黄色の固体として収集します。

   • きれいな25mLの試験管をビーカーに入れ、きれいなヘラを使って3-ニトロフタルヒドラジドを試験管に移します。
   • ビュヒナー漏斗を脇に置き、試験管をブンゼンバーナーにクランプします。フィルターフラスコは後で使用するためにそのままにしておきます。
   • では、10mLメスシリンダーを使用して、約3 mLのNaOHを3 mL取得します。水酸化ナトリウム溶液を試験管に注ぎ、3-ニトロフタルヒドラジドが溶解するまでガラス棒で混合物を攪拌します。
   • さて、風袋引きされた計量ボートで2gのジチオン酸ナトリウムを計量し、試験管に加えます。3mLの脱イオン水を入手し、チューブに注ぎます。
   • 混合物をよくかき混ぜて、できるだけ多くの固体を溶かします。次に、試験管にきれいな沸騰チップをいくつか追加し、ブンゼンバーナーに点火します。
   • 混合物を中火で沸騰するまで加熱し、5分間沸騰させます。
   • 待っている間に、氷酢酸を1.5mL量ってフードに持ってきてください。
   • 反応混合物が5分間沸騰したら、ブンゼンバーナーを止め、酢酸をチューブに加えます。混合物を室温まで冷まします(通常は10〜15分かかります)。その間、600mLのビーカーに氷浴を準備します。
   • 混合物が冷めたら、氷浴に入れ、ルミノールが沈殿するまで15分待ちます。
   • きれいなビュヒナー漏斗と新しい濾紙を使用して真空ろ過セットアップを組み立て直し、氷浴でさらに10mLの脱イオン水の冷却を開始します。
   • ルミノールが氷浴に少なくとも15分間入ったら、濾紙を冷水で濡らします。次に、真空ろ過により固体ルミノールを回収します。
   • 沸騰したチップを取り出し、ルミノールをさらに冷水ですすいでください。漏斗からの液体の滴りが止まったら、バキュームをオフにして、ルミノールを50mLビーカーに移します。
   • 次に、結合した濾液を廃棄する準備をします。まず、250mLのビーカーに「ヒドラジンとジチオナイト廃棄物」とラベルを付けます。ろ液をビーカーに移し、フラスコを脱イオン水ですすいで、残留ヒドラジンとジチオナイトを除去します。
   • 次に、濾液を10mLの脱イオン水で希釈します。次に、10 mLの1 M炭酸ナトリウムを測定し、結合したろ液に加えます。
   • 50mLメスシリンダーを廃棄物フードに持って行きます。10%次亜塩素酸ナトリウム40mLを測定し、濾液混合物に注ぎます。ビーカーをホットプレートに置き、攪拌棒を追加し、ビーカーに温度計を固定します。
   • 攪拌しながら混合物を50°Cに加熱します。混合物は、残ったヒドラジンとジチオナイトを酸化するために50°Cに1時間滞在する必要があるため、温度が安定していることを確認し、ラボの最後の部分を開始する前にタイマーを1時間に設定してください。
3. 化学発光と蛍光Expand

   ラボの最後の部分では、ジメチルスルホキシドで作ったルミノールの一部を固体の水酸化カリウムに混ぜます。ヒドロキシルイオンは2つのアミン基を脱プロトン化します。次に、周囲の酸素がルミノールジアニオンを励起状態で3-アミノフタレートまたは3-APAに酸化します。この不安定な複合体は、すぐに基底状態にリラックスし、エネルギーを可視光として放出します。励起された3-APAは化学反応の産物であったため、放出された光は化学発光と呼ばれます。

   酸化反応による化学発光を確認したら、蛍光分子であるフルオレセインを混合物に加えます。励起された3-APAの中には、光を放出するのではなく、エネルギーを直接フルオレセインに伝達するものがあり、2つの異なる発光化合物による溶液が得られます。

   • では、作ったルミノールを約0.2g測定し、15mLの三角フラスコに入れます。固形物がまだ湿っていても大丈夫です。
   • 5〜7ペレットの水酸化カリウムを入手し、フラスコに注ぎます。次に、フラスコ、ストッパー、10mLメスシリンダーを溶剤フードに持って行きます。
   • DMSOを2mL測定し、フラスコに加えて栓をします。メスシリンダーをヒュームフードに入れ、フラスコを暗い部屋に持って行きます。
   • 化学発光が見えるまでストッパー付きのフラスコを激しく振ってから、フラスコを下ろします。酸化と緩和の両方が速いプロセスであるため、光はすぐに消えます。
   • フラスコを振って、フラスコを開かずにさらに6〜10回光を弱めます。フラスコ内の酸素が消費されるにつれて、光は徐々に暗くなります。手記：明るくするには、ドラフト内のフラスコを1分間開いたままにして、酸素を補充します。
   • フラスコを閉じて暗い部屋に戻り、再度フラスコを振って効果を確認します。
   • さて、0.2gのフルオレセイン染料を測定し、フラスコに加えます。フラスコを止めて暗い部屋に戻ります。フラスコを激しく振って混合物が明るく輝くまで動かし、その後置いてルミノールのみの色の違いを観察します。
   • 終わったら、濾液を確認してください。50°Cで少なくとも1時間経ったら、ホットプレートの電源を切り、ビーカーが室温まで冷えるのを待ちます。
   • 次に、濾液に約10mLの水道水を加え、排水溝に流します。
   • 残った化学物質とガラス廃棄物を適切な容器に捨て、ガラス製品と道具を掃除し、実験器具を片付けてください。
4. ResultsExpand

   お客様の酸化反応条件下では、励起された3-APAは弛緩すると500nm付近の広い範囲で青緑色の光を放出し、フルオレセインは480〜490nmおよび515〜525nmの光を吸収して励起されます。

   ルミノール酸化反応混合物にフルオレセインを添加すると、励起された3-APAは、フルオレセインが光として吸収するエネルギーを、非放射エネルギー伝達と呼ばれる特別な相互作用で近くのフルオレセイン分子に直接伝達できます。結果として生じる励起されたフルオレセインは、リラックスすると黄緑色の光を発します。

   励起された3-APAは非常に不安定であるため、非放射エネルギー伝達のために十分に近くにフルオレセインがない場合、通常どおり光を発してリラックスします。したがって、最終的な輝く混合物のスペクトルは、青緑色と黄緑色の両方の光からの寄与を示します。