染料のUV-Vis分光法

出典:Lara Al Hariri氏とAhmed Basabrain氏(米国マサチューセッツ州アマースト校

1. 吸光度波長比較Expand

   ラボの最初の部分では、紫外線および可視光吸収分光法、またはUV-Vis吸収分光法を使用して、フルオレセイン、β-カロチン、およびインディゴ染料の吸収特性を分析します。UV-Vis分光法を実行するには、光源と光検出器の間に溶液を配置します。分子は、電子を励起し、残りの電子を散乱または透過するために必要なエネルギーに対応する波長の光を吸収します。

   吸収スペクトルは、検出器に到達する各波長の光子の数の変動を表します。吸光度が高いほど、その波長で検出される光子の数が少なくなります。最初に純粋な溶媒のスペクトルを取り、装置が色素溶液のスペクトルからそれを差し引いて、染料からの吸光度データのみを表示します。このリファレンスは、ソルベントブランクと呼ばれます。

   • 始める前に、白衣、安全メガネ、手袋を着用してください。手記： β-カロチン溶液とインジゴ溶液は、それぞれヘキサンとジメチルホルムアミドを使用しているため、ドラフト内で染料を扱います。DMFやヘキサンは薄いニトリル手袋を分解してしまうので、溶剤が付着した場合は手袋を交換しましょう。
   • さあ、きれいな石英キュベットを手に入れましょう。キュベットには通常、2つの透明な側面と2つのテクスチャまたは不透明な側面があります。透明な側面を清潔に保つために、常にキュベットをテクスチャーのある側面で保持してください。
   • まず、水中のフルオレセイン溶液を分析します。溶剤をブランクにするには、キュベットの約3/4を脱イオン水で満たします。
   • 次に、キュベットの透明な側面を実験室のワイプで清掃します。キュベットに気泡がないか確認し、キュベットを軽くたたいて気泡を取り除きます。
   • 次に、キュベットを分光器に持って行きます。分光器のサンプルチャンバーを開き、最後にもう一度キュベットを清掃します。汚れやほこりは光を吸収または反射する可能性があり、データにエラーが生じます。
   • 次に、キュベットをサンプルホルダーに挿入して、透明な側面が光源と一直線になるようにします。サンプルチャンバーのドアを完全に閉めます。分光器ソフトウェアの指示に従って、200〜800 nmの吸光度のスキャンを設定し、キュベットを溶媒ブランクとしてスキャンします。
   • スキャンが終了したら、キュベットを空にし、圧縮空気を使用して大きな水滴を取り除きます。
   • 次に、それを共有フードに持って行き、清潔なパスツールピペットを使用して、キュベットの3/4を提供された3μMフルオレセイン溶液で満たします。
   • キュベットに気泡がないか確認し、必要に応じてそれらを取り除き、キュベットを分光計に持って行きます。キュベットをサンプルチャンバーに入れる前に、最後にもう一度透明な面を清掃することを忘れないでください。次に、キュベットをサンプルとしてスキャンします。
   • スキャンが終了したら、フルオレセインが吸収した波長を特定します。吸光度が最も高い波長を_λmaxと呼びます。
   • 吸光度ピークの波長と全体的な吸収範囲をラボノートに記録し、データを保存します。

     表1:染料の吸光度と_λmax

     	> 吸光度範囲 (nm)	>λmax (nm)
     フルオレセイン
     β-カロチン
     インジゴ

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   • さて、キュベットを水溶液の廃棄物に空にし、水ですすいで微量のフルオレセインを取り除きます。
   • 次にβ-カロテンを分析するので、ヘキサン溶媒ブランクが必要です。キュベットをヘキサンで数回すすぎ、残った水を取り除き、純粋なヘキサンを3/4満たします。
   • 気泡を取り除き、キュベットの側面を清掃し、分光器に入れます。スキャンが200〜800 nmの吸光度に設定されていることを確認してから、キュベットを溶媒ブランクとしてスキャンします。
   • スキャンが終了したら、キュベットを有機廃棄物に空にし、圧縮空気で乾燥させます。
   • 清潔なピペットを使用して、キュベットの3/4に提供された3μMのβ-カロチン溶液を満たし、分光計に戻ります。
   • キュベットの透明な側面を清掃し、分光計に入れて、サンプルとしてスキャンします。ラボノートにピークの波長を書き込み、データを保存します。
   • では、藍染料を分析してください。藍液はDMFに含まれているため、キュベットを有機廃棄物に空にし、残ったβカロチンとヘキサンを純粋なDMFで洗い流します。
   • キュベットの3/4を純粋なDMFで満たし、分光計に入れ、スキャン設定が以前と同じであることを確認してください。溶剤ブランクスキャンを実行し、キュベットを有機廃棄物に空にして、圧縮空気で乾燥させます。
   • 清潔なピペットを使用して、キュベットの3/4を提供された3μMのインディゴ色素溶液で満たし、サンプルとしてスキャンします。吸光度情報を書き留めて、データを保存します。
   • 最後に、キュベットを有機廃棄物に空にし、アセトンですすいでください。
2. β-カロテン検量線Expand

   ラボの後半では、UV-Vis分光法を使用して、濃度の異なる5つのβ-カロテン溶液の吸光度を測定することにより、吸光度強度とβ-カロチンの濃度を関連付けます。これにより、吸光度とβ-カロチン濃度の検量線を作成し、その関係を説明する方程式を導き出すことができます。

   • まず、ラボノートに450nmでのβ-カロチン濃度と吸光度のカラムを含むテーブルを作成します。

     表2:β-カロチンの吸光度

     試験	濃度(μM)	λmax(450nm)での吸光度
     1	1.9
     2	3.7
     3	7.5
     4	11
     5	15

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   • 次に、きれいなキュベットを手に入れて、溶媒ブランクとしてヘキサンを3/4いっぱいに満たします。
   • 気泡を取り除き、キュベットの透明な側面を清掃して、分光器に入れます。200〜800 nmの吸光度スキャンを設定し、キュベットを溶媒ブランクとしてスキャンします。
   • スキャンが終了したら、キュベットを有機廃棄物に空にし、圧縮空気で乾燥させます。
   • 次に、清潔なピペットを使用して、キュベットに最低濃度の溶液である1.9μMのβ-カロテン溶液を3/4いっぱいに満たします。
   • キュベットの側面を清掃し、分光器に挿入してサンプルとしてスキャンします。
   • スキャンが終了したら、450nmのピークの吸光度強度を表示します。これを1.9 μM溶液の吸光度としてラボノートに記録します。
   • さて、キュベットを有機廃棄物に空にし、ヘキサンですすぎ、圧縮空気で乾燥させます。
   • 清潔なピペットを使用して、キュベットの3/4を3.7μMのβカロチン溶液で満たします。キュベットの側面を清掃し、分光計に挿入して、別のサンプルとしてスキャンします。
   • スキャンが終了したら、450nmのピークの吸光度を書き留めます。残りの溶液についても、これを最低濃度から最高濃度まで繰り返します。完了したら、データを保存します。
   • 最後に、キュベットを有機廃棄物に空にし、アセトンできれいにします。
3. ResultsExpand

   まず、3つの染料のスペクトルを見てください。水中のフルオレセインは青色と紫色の光を吸収し、最大吸光度は490nmです。赤色光を吸収せず、黄色と緑色の光のみを吸収します。これと一致して、固体フルオレセインは赤で、フルオレセイン溶液は通常黄色から緑色です。

   β-カロチンは、青色と紫色の光も吸収します。ヘキサン中のβ-カロチンの最大吸光度は450nmで、478nmには別の大きなピークが見られます。紫色の光の強い吸収は、β-カロチンがオレンジ色に見える理由の一部です。

   DMF中のインディゴは、紫外線と赤色、オレンジ色、黄色の光を吸収し、611nmに明確なピークを示します。このように、藍染料は主に青と紫の光を反射し、その特徴的な色を与えます。

   • 次に、β-カロチン濃度の検量線を作成します。ラボの後半から 450 nm での β-カロチン吸光度の値を溶液の濃度に対してプロットします。
   • 次に、トレンドラインを適用し、データに適合する線形方程式を見つけます。ランベルト ベールの法則によれば、この式では、y は吸光度、x は濃度、傾きは関連するモル減衰係数と光路長の積です。
   • 方程式を確認してください。濃度を解くように再配置し、ラボの最初の部分から 450 nm で β-カロチン吸光度を埋めます。計算された濃度は3μM / Lに近いはずです。