サザンブロット

サザンブロッティングは、標識DNAプローブが標的DNAとハイブリダイズして、ゲノム内の特定の配列を検出する技術です。

この技術は、最初に開発した英国の生物学者、エドウィン・サザンにちなんで名付けられました。

この手順は、電気泳動、変性、膜転写、ハイブリダイゼーション、および視覚化の5つの主要なステップに従います。

まず、ゲノムDNAを制限酵素で消化し、得られたDNA断片をアガロースゲルにロードし、ゲル電気泳動を用いて分離します。

二本鎖DNAを変性または2本鎖DNAまたはssDNAに分離するために、ゲルを水酸化ナトリウム溶液に浸します。

次に、ゲルを塩化ナトリウムとトリス緩衝液を含むDNA中和溶液のスポンジに置き、pHを7.0にリセットします。

次に、ナイロンメンブレンをゲルの上に置き、ペーパータオルの束で重さを量ります。ssDNAは毛細管現象によって膜上に移動し、中和溶液中の高塩濃度はDNAの結合を助けます。

紫外線を照射すると、DNAはメンブレンに共有結合します。これにより、拡散が防止され、DNAバンドが固定されます。

次に、膜を変性したサケ精子DNAの溶液に浸します。この溶液はメンブレンをコーティングし、プローブDNAとの非特異的結合を防ぎます。

プローブは、標的DNA断片と相補的な配列を持つ短い一本鎖DNAです。可視化のために、プローブは放射性リン(P-32)で標識されるか、または容易に検出可能な生成物を生成する酵素で標識されます。

メンブレンをプローブを含む緩衝液に浸し、42°Cで加温すると、標的ssDNAは相補的プローブDNAとペアになり、標識されたハイブリッド二本鎖DNAが形成されます。

一晩のハイブリダイゼーション後、メンブレンを洗浄して、結合していないプローブを除去します。

放射性標識DNAの場合、メンブレンは検出のためにX線フィルムに曝されます。

酵素標識プローブは、適切な基質を添加し、色や発光の進展に応じてバンドを可視化することで検出できます。標識されたプローブは目的のDNA配列にのみ結合するため、目に見えるバンドはターゲットDNAの存在を示します。