RACE - cDNA末端の急速増幅

新規なmRNA遺伝子転写産物が最初に発見されたときには、必ずしも完全長cDNAが得られるわけではありません。mRNAテンプレートの末端に未知の配列が存在すると、cDNAが部分的にクローニングされる可能性があります。

これらの部分的なcDNAの配列は、転写産物の完全なcDNAを得るために、Rapid Amplification of cDNA EndsまたはRACEと呼ばれる技術によって拡張することができます。

この手法では、アンカー型PCRを使用して、既知の内部部位から欠落している配列をmRNAの3'末端または5'末端にクローニングします。

3' RACEでは、逆転写酵素と、アンカーと呼ばれるユニークなヌクレオチド配列に結合したオリゴ-dT配列からなるハイブリッドプライマーを用いて、mRNAテンプレートからcDNAを合成します。

オリゴ-dTは、成熟mRNAの3'末端に見られるポリAテールに結合し、プライマーのアンカー部分は、新たに合成された最初のcDNA鎖のポリT配列の上流に独自のヌクレオチドのセットを追加します。

cDNA配列の既知の末端とペアになることができる遺伝子特異的プライマーまたはGSPを使用して、2本目のDNA鎖を合成します。新しいDNAは変性され、アンカー配列に相補的なアダプタープライマーとGSPをPCRの複数回ラウンドで使用して、欠落している3'配列を埋めて増幅します。

5' RACEでは、逆転写中に遺伝子特異的プライマーがmRNAの3'末端に結合します。次に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、得られたcDNAの3'末端にポリAテールを追加します。

逆転写後、オリゴdTおよびアンカー配列を含むアダプタープライマーを使用して相補鎖を合成します。次に、遺伝子特異的プライマーとアダプタープライマーを使用して、完全なcDNA配列をコピーして増幅します。

どちらのタイプのRACEでも、アダプタープライマーはオフターゲットcDNAに結合して増幅できます。

したがって、第2の増幅サイクルは、PCRの最初のラウンドからのプライマーの下流に結合するネストされたプライマーを使用して実行されます。これにより、特異的な完全長cDNAの収量が増加します。