16.1: In-vitro 変異原性

遺伝子の機能を知るためには、遺伝子を不活性化したり、ノックアウトしたりすることで、何が起こるかを観察できます。ノックアウトマウスは、がん、パーキンソン病、糖尿病などのヒトの病気のモデルとして特に有用です。

プロセス

遺伝子をランダムにノックアウトする方法と、特定の遺伝子をターゲットにする方法があります。特定の遺伝子をノックアウトするには、ターゲティング・ベクターと呼ばれる人工的に作られたDNAを使用して、正常な遺伝子を置き換え、それによって不活性化します。

ターゲティングベクターは、目的とする遺伝子の両脇の配列と同一もしくは相同の配列を持っており、減数分裂の際に類似した配列を持つDNA間で自然に起こる相同組換えによって、ターゲティングベクターが遺伝子を置き換えることができます。

ターゲティングベクターは、電気パルスを用いて細胞膜に一時的に孔を開けるエレクトロポレーション法などを用いて、培養中のマウス胚性幹細胞に導入されます。一般的には、ベクターが適切に遺伝子を置換した細胞を識別するために、相同領域の間にネオマイシン耐性（Neo^R）の遺伝子などの正の選択マーカーを、相同領域の1つの後にウイルスのチミジンキナーゼ（TK）の遺伝子などの負の選択マーカーを含むように設計されています。

細胞をネオマイシンに曝すと、ベクターをDNAに組み込んだ細胞だけがNeo^R遺伝子を持っているので生き残ります。また、ベクターが相同組換えによって目的の遺伝子に置き換わった細胞は、TK遺伝子を持たないので、ガンシクロビルという薬の存在下でも生き残ることができます。したがって、ガンシクロビルを投与することで、ゲノムにベクターがランダムに挿入された細胞は、TK遺伝子を持つことになるため、排除できるのです。

正しく遺伝子がノックアウトされた細胞は、マウスの胚に挿入され、メスの子宮に移植され、出産まで成長します。できあがったマウスは、胚から採取した正常なDNAを持つ細胞と、遺伝子を1本の染色体上にノックアウトした細胞が混在したキメラマウスとなります。これらのマウスを交配し、その生殖細胞に遺伝子を持つ子孫をさらに交配して、すべての細胞がノックアウトのホモ接合体であるマウスの系統を作ります。このノックアウトマウスを用いて、遺伝子の機能を研究できます。

科学者は動物の遺伝子を 無効化またはノックアウトすることができます 典型的にネズミを用いて、遺伝子の機能を研究します 通常、人工的なDNAの一端であるターゲティングベクターと 入れ替えることによって行います ターゲティングベクターは、遺伝子の前後の配列と 相当かつ同一の配列を持っています それはまた、陽性選択マーカーを持っており ネオマイシン抵抗遺伝子や 中間にNeoRを持っています。陰性選択マーカーとして チミジンキナーゼ遺伝子、TKが末尾に付きます 胚性幹細胞に導入される際 相同組み替えと通じて遺伝子を置換し 配列が類似するDNAの一部との間で 自然に行われます 遺伝子が正常に置換された細胞は 陽性マーカーを含みますが、陰性マーカーは含みません こうして、性質によって特定が可能になります これらの細胞は、ネズミの胚に挿入され メスの子宮内に移植されます その結果、ネズミは通常の細胞と 1つの染色体がノックアウトされた遺伝子を持つ細胞を持ちます これらのネズミは、飼育され 通称ノックアウトマウスを生成します 全細胞内に同型接合的なノックアウトが見られます