リボソームプロファイリング

転写され、タンパク質に翻訳されるゲノム内の領域を特定することは、ゲノムとその発現を理解するための重要なステップです。

これは、ribosome profiling(ribo-seqとも呼ばれる)と呼ばれる手法で実現されます。mRNA上のリボソームの位置をマッピングし、タンパク質に活発に翻訳されているmRNAを特定します。

RNAを単離するには、まず細胞を溶解して、その中の分子にアクセスする必要があります。次に、ライセートをRNaseで処理します。これらの酵素は、リボソームで覆われていないmRNAを切断し、保護されたmRNA断片のみを残します。

次に、リボソームで保護されたフラグメントは、スクロース勾配を使用して、保護されていない切断されたフラグメントから分離されます。

次に、リボソームをmRNAフラグメントから除去し、酵素逆転写酵素を使用してRT-PCRによってRNAをDNAに変換します。

次に、DNAの配列を決定し、参照ゲノムにマッピングします。これにより、各mRNAに沿ったリボソームの正確な位置が決定されます。

リボソームプロファイリングは、認識されないオープンリーディングフレームまたはORFの同定にも役立ちます。ORFは、開始コドンと終止コドンの間にあるDNAの領域で、タンパク質に翻訳できます。ORFの発見は、新しい遺伝子の同定に役立ちます。

哺乳類の細胞株における遺伝子発現パターンの研究について考えてみましょう。実験手順では、細胞を刺激にさらし、遺伝子発現をオンにしてmRNA合成を開始する可能性があります。

活発に翻訳されているmRNAは、リボソームプロファイリングを使用して同定されます。

この実験により、遺伝子Bは翻訳されているのに対し、遺伝子AとCは翻訳されていないことが明らかになりました。

また、約100ヌクレオチドの長さのゲノムの小さな領域が活発に翻訳されていることも示しています。

この認識されていない領域は、実験刺激によってアップレギュレーションされる新規タンパク質をコードする可能性のあるオープンリーディングフレームです。