15.16: 制限酵素

制限酵素は、DNAを配列特異的に切断するために使用される細菌酵素です。DNAを切断するために、それらは制限部位と呼ばれる特定の回文配列に結合します。このような回文DNA配列または逆反復は、複製の起源、遺伝子オペレーター部位、転写終結シグナルを含む領域など、機能的に重要な領域に一般的に見られます。

宿主細菌は、これらの部位をメチル化することにより、これらの酵素から自身のゲノムDNAを保護します。一部の細菌は、DNAを切断する能力と、DNAを同じ配列特異性でメチル化する能力の両方を持つ酵素を持っています。EcoRIは、同一のサブユニットの二量体である場合、制限酵素として機能します。モノマーとして、メチラーゼとして機能します。他の細菌は、各機能を実行するために2つの異なる酵素を持っています。この制限と改変の戦略により、細菌ウイルスが細菌ゲノムを攻撃するのを防ぎます。

細菌種が異なれば制限酵素も異なるため、各酵素には固有の制限部位があり、起源の細菌にちなんで名付けられます。例えば、EcoRIは大腸菌RY13株から分離されています。

DNAを特定の制限酵素で消化すると、生成されたすべてのフラグメントは、5'末端と3'末端で同じ配列を持ちます。したがって、プラスミドDNAとインサートを同じ制限酵素で切断すると、簡単にライゲーションできる相補的な末端が得られます。通常、フラグメントをアガロースゲル上で分析し、消化されたDNAの長さがフラグメントの予想長さと一致することを確認します。

単離されたDNAは、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれる酵素によって特定の部位で切断することができます。

制限酵素は細菌から単離されます。彼らは、回文配列の4〜8個の特定のヌクレオチドでDNAを認識して切断します。1 つのストランドでは 5' から 3' の方向に、相補的なストランドでは 3' から 5' の方向に同じものを読み取るシーケンス。

エンドヌクレアーゼが相補的なDNA鎖上で互いに対向する2つの塩基間で対称的に切断されている場合、結果として得られるDNA断片の末端は鈍いものになります。

エンドヌクレアーゼが2本のDNA鎖を横切ってずらしてカットし、各フラグメントに不対塩基のオーバーハングが残る場合、DNAフラグメントの末端は粘着性があると言われます。

DNA断片の粘着性のある末端は、同じ制限酵素によって切断された別のDNA片の一本鎖オーバーハングと対になることがあります。

配列特異的な末端を持つ異なるDNA断片を結合して、新しい組換えDNAコンストラクトを形成することができます。