32.8: カラムクロマトグラフィーの原理

クロマトグラフィー技術は、有機溶媒を使用して植物の色素を分離するために、1901 年にロシアの植物学者 Michael S. Twett によって初めて発明されました。 さらに、1941 年に、Archer John Porter Martin と R. L. M. Synge は、シリカゲルをカラムに充填することによってこの技術を改良しました。 次に、移動相としてクロロホルムと水の混合物を使用し、充填カラム上でアミノ酸の混合物を分離しました。 これはカラムクロマトグラフィーに関する最初の報告でした。 現在、カラムクロマトグラフィーは、サンプル混合物からさまざまな種類の化合物を分離するために広く使用されている技術です。

タンパク質の効率的な分離に影響を与える要因

カラムの材質、充填物、流量や温度などの操作条件などのさまざまなパラメータによって、カラムクロマトグラフィーによる分離の効率が決まります。

カラムの材質またはマトリックスの選択により、サンプルとの相互作用の程度が決まります。 マトリックス材料はカラム内にしっかりと均一に充填されている必要があります。 気泡、破片、大きな粒子、沈殿物は、カラムを通る溶媒の均一な流れを妨げ、分離効率に影響を与えます。 また、カラムには粒子状物質が存在しない必要があります。

カラムに注入されるサンプルは透明であり、カラムを詰まらせて溶媒の流れを妨げる可能性のある凝集物が存在しない必要があります。 溶媒の流量も分離に影響します。 溶媒の流量が非常に高い、または非常に低いと、化合物や不純な調製物の分離が非効率になります。 また、流量が非常に高いとカラムの充填が乱れ、プロセス効率に影響を与える可能性があります。 さらに、溶出バッファーの組成も重要な要素です。 その場での沈殿や溶解を防ぐために、非腐食性であり、サンプルおよびカラムの材質と適合する必要があります。

もう 1 つの操作パラメータである温度も、プロセスにおいて重要な役割を果たします。 これにより、サンプル、カラム材料、および溶媒バッファーの安定性が決まります。 また、カラム全体の温度が一定であるため、化合物が効率的に分離されます。 分離プロセスの完了後、その後の分析でのサンプルの汚染を避けるために、適切な溶媒を繰り返し通過させてカラムを徹底的に洗浄する必要があります。 場合によっては、詰まった物質を除去するために、溶媒をカラムに逆方向に通過させます。

制限事項

非常に広く使用されている技術ですが、この方法にはまだいくつかの制限があります。 化合物の分離を良くするには流速を遅くする必要があるため、非常に時間がかかる方法です。 また、移動相に大量の高純度の溶媒が必要なため、プロセスが高価になります。 これにより、より高収率の純粋な化合物が必要な場合のスケールアップのコストも上昇します。

カラムクロマトグラフィーは、化合物の物理的および化学的特性に基づいて化合物を分離するために使用される生化学的手法です。

これには、固体固定相またはマトリックスと液体移動相または溶媒の2つの主要コンポーネントがあります。

マトリックス充填カラムには、タンパク質混合物などのサンプルがロードされます。次に、溶媒を使用してサンプルをカラムに運びます。

カラム内では、マトリックスは分子メッシュとして機能し、タンパク質のサイズまたはマトリックスとの相互作用に基づいてタンパク質をフィルタリングします。大きいタンパク質は小さなタンパク質よりも速く移動する傾向があり、サイズベースの分離につながります。

さらに、サンプル中のタンパク質がマトリックスと相互作用する可能性があります。相互作用が弱いとタンパク質は素早く通過し、強い相互作用はタンパク質をカラム内に保持します。

溶媒のpHまたはイオン強度が徐々に変化すると、タンパク質とマトリックスとの相互作用が変化し、タンパク質が別々の画分に溶出するのに役立ちます。