32.8: カラムクロマトグラフィーの原理

クロマトグラフィー技術は、1901年にロシアの植物学者であるマイケル・S・ツエットによって、有機溶媒を使用して植物色素を分離するために最初に発明されました。さらに、1941年に、アーチャーのジョン・ポーター・マーティンとR.L.M.シンジは、シリカゲルをカラムに充填することにより、この技術を変更しました。次に、アミノ酸の混合物を、クロロホルムと水の混合物を移動相として使用して、充塡カラム上で分離しました。これは、カラムクロマトグラフィーに関する最初の報告でした。現在、カラムクロマトグラフィーは、サンプル混合物からさまざまな種類の化合物を分離するために広く使用されている手法です。

タンパク質の効率的な分離に影響を与える要因

カラムの材質、充塡剤、流量や温度などの運転条件などのさまざまなパラメーターによって、カラムクロマトグラフィーによる分離の効率が決まります。

カラムの材質またはマトリックスの選択によって、サンプルとの相互作用の程度が決まります。マトリックス材料は、カラム内にしっかりと均一に充填されている必要があります。気泡、異物、大きな粒子、沈殿物は、カラム内の溶媒の均一な流れを妨げ、分離効率に影響を与えます。また、カラムには粒子状物質が含まれていないことが必要です。

カラムに注入するサンプルは透明で、カラムを詰まらせて溶媒の流れを妨げる可能性のある凝集体がないことが必要です。溶媒の流速も分離に影響します。溶媒の流速が非常に高いまたは非常に低いと、化合物や不純な調製物の分離が非効率的になります。また、非常に高い速度はカラム充塡を妨げ、プロセス効率に影響を与える可能性があります。また、溶出バッファーの組成も重要な要素です。非腐食性で、サンプルやカラム材料に適合し、in situの沈殿または溶解を防ぐ必要があります。

また、このプロセスでは、別の操作パラメータである温度も重要な役割を果たします。これは、サンプル、カラム材料、および溶媒バッファーの安定性を決定します。また、カラム全体の温度を一定にすることで、化合物を効率的に分離します。分離プロセスが完了したら、適切な溶媒を繰り返し通過させてカラムを徹底的に洗浄し、その後の分析でサンプルが汚染されないようにする必要があります。場合によっては、詰まった材料を取り除くために、溶媒をカラムで逆方向に通過させます。

制限

非常に広く使用されている手法ですが、この方法にはまだいくつかの制限があります。化合物の分解能を向上させるためには流速を遅くする必要があるため、非常に時間のかかる方法です。また、移動相には高純度の溶媒が大量に必要とされるため、このプロセスは高価になります。これにより、高純度化合物の収率向上が必要な場合のスケールアップコストも上昇します。

カラムクロマトグラフィーは、化合物の物理的および化学的特性に基づいて化合物を分離するために使用される生化学的手法です。

これには、固体固定相またはマトリックスと液体移動相または溶媒の2つの主要コンポーネントがあります。

マトリックス充填カラムには、タンパク質混合物などのサンプルがロードされます。次に、溶媒を使用してサンプルをカラムに運びます。

カラム内では、マトリックスは分子メッシュとして機能し、タンパク質のサイズまたはマトリックスとの相互作用に基づいてタンパク質をフィルタリングします。大きいタンパク質は小さなタンパク質よりも速く移動する傾向があり、サイズベースの分離につながります。

さらに、サンプル中のタンパク質がマトリックスと相互作用する可能性があります。相互作用が弱いとタンパク質は素早く通過し、強い相互作用はタンパク質をカラム内に保持します。

溶媒のpHまたはイオン強度が徐々に変化すると、タンパク質とマトリックスとの相互作用が変化し、タンパク質が別々の画分に溶出するのに役立ちます。