アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

サマリー

の複雑な運動挙動の研究キイロショウジョウバエ与えられたハエの動きの変化を定量化する能力に依存しています。この記事では、高分解能のトラッキングシステムを使用してこれを行う方法を示します。

要約

ハエは、この分野の研究者に利用可能な遺伝的なツールの過多に起因する複雑な挙動を研究するための重要なモデルを提供しています。における運動行動を研究して

プロトコル

パート1：ハエの餌と管理

1. ハエは、酵母のない標準のメディアを含むボトルで増殖させてください。あなたは、ハエを大量に必要になりますので、十字架は、それに応じて設定する必要があります。 25℃で暗サイクル：ハエは、12時間の光で栽培する必要がある
2. ハエはすぐに羽化（1-3日）後に収集する必要があります。ハエは、二酸化炭素のディフューザーを使用して、この段階で働いたことができ、オートクレーブまたは酵母培地を含む試験管にソートしておく必要があります。我々は、試験管にのみ、保存されている男性10を使用してください。
3. 行動実験を実行する前に、二酸化炭素の使用後に少なくとも一日か二日を許可する。私たちは行動アッセイ3-5日以下の羽化にハエを実行する。
4. アッセイは、常に概日リズムの問​​題を回避するために、毎日同じ2〜3時間の時間ウィンドウ内で実行する必要があります。

パート2：管理された環境での追跡システムのセットアップ

1. 全ての実験は、70％の湿度と25℃の一定温度を維持する環境の部屋で行われます。
2. （カメラが下向き）に記録される領域の上にデジタルビデオカメラを一時停止します。私たちのトラッキングソフトウェアは、コントラストをベースにしているので、我々は、ライトボックス上のカメラを一時停止する。カメラは、FireWire接続を介して直接のDellコンピュータにビデオを記録します。我々は、ビデオの取り込みのためのWindows映画制作者（Vistaのバージョン）でのDellコンピュータにフックアップする、シャープデジタルビデオカメラを使用してください。
3. 空気パルスがこのプロトコルで投与される、空気の流れのソースは、客室内に存在しなければならないので。ゴムチューブを使用して、空気ろ過用活性炭フィルターに空気源を接続してください。
4. より多くのゴ​​ムチューブを使用して、中空のゴム栓を経由して三角フラスコに活性炭フィルターの反対側を接続し、そして水の半インチ程度とフラスコを埋める。これは、空気を加湿します。
5. フラスコには、ゴムチューブを経由してY字型バルブに接続するサイドアームを、持つ必要があります。
6. Y -バルブの一枝は、流量計に接続する必要があります。他の支店は、正方形の運動室に空気を配布する必要があります。

パート3：運動室にハエを配信

1. 正方形の運動室は、Wolf らの設計に基づいています。2002年^1は 、チャンバ内に飛んでからハエを防ぐための小さなドロップトレイを追加して。チャンバーを分解する必要があり、すべてのコンポーネントが完全に70％エタノールでダウン拭いて、使用前に乾燥する必要があります。
2. すぐに行動試験を行う前に麻酔は、潜在的にパフォーマンスが損なわれる可能性があります。これを避けるために、ハエが優しく小さなアウトレットで漏斗を用いてチャンバーにノックされています。正しいサイズのアウトレットを作成するには、漏斗の端に青色のピペットの先端を（P1000用）を取り付けます。通過するフライ用に十分な開口部が大きいために、ピペットチップの非常に端を切断するはさみを使用してください。
3. 私たちの部屋の上部は、エッジの周りのねじで固定プレキシガラスの小片です。ネジが削除されたときに、穴がチャンバー内にハエを提供するために使用することができます。ネジ穴は、ネジが正常に座っている場所の代わりに、内部の部屋の上に直接座っているように、プレキシガラスの上に置きます。ハエを含む試験管を取るし、ネジ穴に配置する必要が漏斗、上の逆さまに置きます。
4. これは、ハエを傷つけたり、破損の原因と、漏斗を移動しないでください。すべてのハエがチャンバー内になるまで、その代わりに、穏やかに、全体のチャンバー、ファンネルとすべてをたたく。このノッキングは、このバンギングの衝撃を吸収するためにマウスパッド上で行ってください。ハエが内側にある場合はネジのベッド上のプレキシガラスの上を、漏斗を削除し、再位置。所定の位置にして再度ネジプレキシガラスのトップ。

パート4：運動アッセイを実行する

1. ハエが正しくロー​​ドされたら、それらを30分間チャンバーに順化てみましょう。この順化期間が制御された環境（25℃、湿度70％）内で起こるべきであり、チャンバーは、（これがオンしてください）​​ライトボックスの上に配置する必要があります。他の部屋の照明をオフにしてください。
2. 順応期間の後、空気のみを流量計に流入するように空気の流れのシステムでY -バルブを切り替える。空気の電源をオンにして、希望の速度（4.0〜6.0 L /分）に空気を増加させる。我々は一般的に5.0〜5.5 L / minを使用しますが、その範囲内の任意の速度で動作します。
3. 希望の対気速度が達成されると、空気が移動チャンバーに流れるようにY -バルブを切り替える。時間は、この空気は、15秒間パルスし、突然空気をオフにしてください。あなたが空気を切るように、モードを記録するカメラを切り替えます。 （この部分は一度にすべてを行うには練習が必要）。
4. 希望の時間後に録画が停止して保存。我々は、毎秒10フレーム（遺伝子型ごとに少なくとも8試験）で30秒の試行を記録する。

パート5：動画の分析

1. 我々は、使用動的画像解析システム^（DIAS）2モーショントラッキングするためのソフトウェア3.2。このソフトウェアを使用するためには、我々は最初のQuickTime 7.5.5で、AVIファイルフォーマットに私たちの動画を変換。
2. コントラストに基づいて、ハエを追跡するために、我々は、関数"しきい値で自動トレース"を使用してください。私たちは、その後、デジタル化への"トレースからパスを作成"機能は、これらのトレースを使用してください。
3. 各フライの瞬時速度を出力するには、我々は（DIAS固有）データベースファイルを生成するために"計算パラメータ"機能を使用してください。この機能を使用して、我々はまた、"5,15,60,15,5"Tukeyの平滑化ウィンドウを使用してデータを平滑化。
4. この情報はデータベースファイルとして出力されると、それはMicrosoft Excelで開くことができます。我々は、Excel内の瞬時速度をコンパイルし、運動のダイナミクスと試合の構造を理解するために必要な追加パラメータを計算するためにMatlabのスクリプトを使用してください。

代表的な結果：

図1は、野生型カントンS生物（図1、左パネル）から代表的なトレースを示しており、二つの大きなオーバーラップ失（DF（3R）X307とDF（3R）x313）（図1を交配することによって生成されたdCASK遺伝子にnullを飛ぶ、）パネル右側。dCASKヌルハエは、以前にビュリダンのパラダイム^3を使用して運動に問題があることが示されている、と私たちのパラダイムでは、カントンSと比較して、彼らは大幅に減少運動を示す。我々は常に条件と動作が特定の日の正常範囲内であることを確認する最初の野生型の微生物を実行します。私たちは、試験日の5％未満で、標準の応答からの偏差を観測した。これらの違いは、通常、私たちの制御された環境のパラメータを持つ問題に起因することができます。

図1。DIAS -生成カントンS野生型のハエ（上記、左）とオーバーラップ欠失（上記、右）から生成された運動欠損dCASKのヌルハエの両方のトレースを。トレースが記録されたビデオで見ていることを象徴している。 80から10ハエから両方の画像contrainトレースは、空気のパルスは、次のビデオトラッキングアッセイで30秒間実行する。

図2野生型のハエは、空気のパルスに続く歩行分析（上）（紫のバー）にして空気パルス（青色）なしで実行されました。分析プログラムによって計算されたすべてのパラメータでは、2つの条件（両側スチューデントt -テストで決定）の間に有意差はなかった。これは空気パルス後、我々のセットアップでは正常に動き回る飛ぶことを示している。

ディスカッション

我々のセットアップでは、やや強い空気のパルスは、一時的にハエの動きを停止します。空気のパルスが終了すると、ハエは、図2に示すように、この定常状態と正常に動き回るから解放されています。この空気のパルスが効果的に人口の移動を同期化されるため、我々はまた勢い破りの刺激に続く運動の発症を学ぶことができるように試験を開始するために使用。開始後自発運動のパラメータが空気パルス（図2）の影響を受けないので、このアッセイは、しかし、空気のパルスなしで行うことができます。

ロコモーションの自動解析で見られるものが頻繁に発生する問題は、衝突の問題です。トラッキングプログラムには、衝突ハエを扱う時悪名高く悪いほとんどの部分です。これらのプログラムは、しばしば衝突時に瞬間的にオブジェクトの"視力"を失う、そしてそれは新しいオブジェクトとして、このオブジェクトのラベルを見つけた上で。結果は、実際にチャンバー内に存在するよりも、トレース、より多くのオブジェクトを持つ出力することができます。多くの人々は、単一のハエをトレースすることでこの問題を解決する。これに明らかな問題は、しかし、その単一...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
正方形チャンバー	ツール	工作ショップ	該当なし	Wolf et al. 20021による設計
デジタルカメラ	カメラ	シャープ	ViewcamZ VL-23
流量計	ツール	Cole-Parmer	SY-32003-12
ライトボックス	ツール	DNASTAR	Seq-Easy
活性炭フィルター	ツール	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	ソフトウェア	Soll technologies	該当なし	www.solltechnologies.com