アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

サマリー

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示していますアフリカツメガエル卵母細胞。

要約

薄切片電子顕微鏡（EM）に続いてアフリカツメガエルの卵母細胞のマイクロインジェクションは、核-細胞質間輸送を研究するための優れたシステムです。大きいため、大核と核膜孔複合体（NPCの）の高密度で、核輸送は、 アフリカツメガエル卵母細胞で容易に可視化することができます。核のインポートとエクスポートのメカニズムに多くの洞察は、このシステムの使用（Pantéによってレビュー、2006）によって得られている。さらに、我々は、ホストの核内で複製するいくつかのウイルスの核移入経路を分析するためにアフリカツメガエルの卵母細胞のマイクロインジェクションを使用している。

ここでは、核移入基板とアフリカツメガエルの卵母細胞の細胞質マイクロインジェクションを示しています。我々はまた、解剖、脱水、およびエポキシ包埋樹脂に卵母細胞の埋め込みを含めて、EMを薄切片による可視化のために注入した卵母細胞の準備を示しています。最後に、我々はバキュロウイルスオートグラファカリフォルニの核多角体ウイルス （AcMNPV）またはマウス（MVM）のパルボウイルスの分のウイルスのキャプシドにマイクロインジェクションされた卵母細胞の代表的な結果を提供し、技術の潜在的なアプリケーションについて説明します。

プロトコル

第1部：マイクロインジェクションのためのアフリカツメガエルの卵母細胞の調製

1. 88 mMのNaCl、1mMのKClを、0.82 mMの：カルシウムを含まない修正バースの生理食塩水でコラゲナーゼ溶液（5 mg / mlのコラゲナーゼの20mlを含む50 mlのコニカルチューブにアフリカツメガエルの卵巣の小片（約2cm）を配置のMgSO _4、10mMのHepes緩衝液、pH7.5）。コラゲナーゼは、卵母細胞を囲む卵胞細胞を除去するために使用されます。
2. シェーカーのプラットフォーム上にチューブを置き、一時間（100 RPMで）軽く揺らし。この時間は、コラゲナーゼの異なるロットによって異なります。こうして一時間後に、卵母細胞の小さなサンプルを取り、解剖顕微鏡下でそれらを調べる。適切にデfolliculated卵母細胞は、よく互いに分離されるべきであり、それは卵母細胞にガラス針を挿入する簡単なはずです。卵母細胞は、十分に脱folliculatedでない場合、それらはコラゲナーゼ溶液に残り、再び5分おきにチェックされます。
3. 修正されたバースの生理食塩水（MBS：88 mMのNaCl、1mMのKClを、0.82 mMのMgSO _4を用い 、0.33 mMのカルシウム（NO _3）2、0.41 mMのCaCl _2を 、10mMのHepes緩衝液、pH7.5）で卵母細胞を3回....

ディスカッション

薄切片EMと組み合わせ、アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクションは、核-細胞質間輸送を研究するための非常に効果的なツールです。このシステムは、細胞質フィラメントおよび核バスケット（Panté、2006年までにレビューさ）のようなNPCの構造部品と核移入基板の例の作用については、NPCを通じて輸入の明確なステップをマッピングするために使用されています。また、核複製ウイルスの核移入を（;レーブら、2003;。コーエンとPanté、2005 Pantéとカン、2002）の研究に使用されています。

ここに示されている細胞質マイクロインジェクション技術の一つのバリエーションは、核外輸送の基質（Panté ら 、1997）の核マイクロインジェクションです。核注入を実行するには、卵母細胞は、動物極が上直面するように配向、マイクロウェルプレートに入れ、そして4℃で一晩インキュベートする。次の日、核が動物極にわずかに隆起領域として表示されるはずです。核が急（45度より大きい）角度で輸出基板の約25 NLでマイクロインジェクションし、E.......