マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
開発中に遺伝子の役割を調査するための不可欠なツールには、遺伝子ノックダウン、過剰発現、およびmisexpressionの研究を実行する機能です。ゼブラフィッシュの（
プロトコル
パート1：マイクロピペットの準備、およびマイクロインジェクションチャンバープレート
- 加熱とマイクロピペットプラー装置でホウケイ酸ガラス毛細管（世界プレシジョンインスツルメンツ社、1B100 - 4）を引いて（サッターインスツル株式会社、フレーミング/ブラウンP - 97）でマイクロピペットを作製。粘土や粘着テープの少量の上にペトリ皿に保管してください。
- 注入中に胚を保持するための簡単な方法（"ゼブラブック"で説明したように）となるくさび形トラフで成形された1 × E3培地プレートに1.5％アガロース（アメリカンBioanlytical、（株）、AB00972 - 00500）を注ぐ（1）寒天チャンバープレートは4℃で使用してストアする前に固化してみましょう
パート2：RNAの調製
遺伝子機能研究のための一つの強力なアプローチは、ゼブラフィッシュ胚のin vitro転写されたキャップRNA に微量注射することです。キャップRNAは、CAPのアナログの存在のために生体内で見られる真核生物のmRNAと同じように振る舞います。ゼブラフィッシュ研究者が日常的に興味のある遺伝子を過剰発現またはmisexpressにこのメソッドを使用しています。このデモでは、EGFP -タグ付き写しを顕微注入するだろうし、成功した注射の....
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ディスカッション
ゼブラフィッシュ胚に微量注入は開発中の特定の遺伝子の役割を探索するための十分に確立し、堅牢なテクニックです。アプリケーションでは、過剰発現、misexpression、および目的の遺伝子だけでなく、複数の遺伝子間のエピスタシスの解析のノックダウンアッセイが含まれています。ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションは広くトランスジェニック動物の生成、および初期の胞胚胚5,6,7,8,9で細胞の運命をマッピングするために使用されています。さらに、この手法の応用は、細胞移植の方法10で生殖系列キメラを生成する上で重要なステップとなります。
遺伝子の"機能獲得型"の表現型を探索するための一つの代替方法は、その遺伝子の構成的活性型を顕微注入することです。さらに、遺伝子の擬似"機能喪失"表現型は、その遺伝子のドミナントネガティブ型のマイクロインジェクションによって検討されることがあります。ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションは、DNAや低分子化合物11,12を含めること.......
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謝辞
この作品は、ZSにNIHとPKD財団によってサポートされていました。全ての動物実験は、イェール大学動物資源センター（YARC）と動物実験の使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行った。
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材料
他のすべての材料は、プロトコルに記載されています。
参考文献
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, ....
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再版と許可
