ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

サマリー

簡単な方法は、小さな組織サンプルから複数の植物ホルモンの迅速抽出と分析ができるようにその提供されています。手順は、厳粛な精製工程として気相の抽出を使用しています。サンプルは主に生成する化学イオン化（M +1）とGC / MS +イオンによって分析されます。

要約

植物ホルモンと関連するシグナリング化合物は、種々の環境刺激やストレスに対する植物の応答の調節に重要な役割を果たす。最も深刻なストレスの中で昆虫草食、病原体感染、および乾燥ストレスがあります。これらのそれぞれについて、その特定のホルモンのセットおよび/またはそれらの組み合わせを強調することにより、植物の生存を確保する、微調整応答することが知られています。これらの応答の調節に関与する主要なホルモンは、ジャスモン酸（JA）、サリチル酸（SA）、およびアブシジン酸（ABA）です。より個々のホルモンの役割だけでなく、これらの応答の間に彼らの潜在的な相互作用を理解するには、空間的な形でだけでなく、時間的にそれらの存在量の変化を監視する必要があります。これらおよび他のシグナリング化合物の、簡単で、感度が高く、再現性の定量化のために我々は気相抽出とガスクロマトグラフィー/質量分析（GC / MS）分析（1、2、3、4）に基づく方法を開発した。酸性水溶液、1 - プロパノールによる植物組織からこれらの化合物を抽出した後、ジクロロメタンと混合カルボン酸含有化合物は、メチル化熱で揮発し、高分子吸収剤で収集されます。サンプルバイアルに溶出後の検体は、ガスクロマトグラフィーによって分離され、化学イオン化質量分析法で検出。適切な内部標準の使用は、分析対象物と内部標準のピーク面積を関連付けることによって、単純な定量が可能になります。

プロトコル

1. まず、抽出のために2ミリリットルのスクリューキャップ付きバイアルを準備する必要があります：400ul抽出バッファーを加え（1 - プロパノール：H2O：濃塩酸2:1:0.002体積/体積/体積）とそれぞれの内部標準の10μlのは（10ng/μl ）バイアルに。液体窒素で凍結し、セラミックビーズを追加。
2. バイアルがまだ液体窒素内に位置している間（50〜200mgの間）植物材料を追加します。追加された植物材料の重量は、生体重に基づいて正確な定量化、のために後で可能にするためにさらに処理する前に推定する必要があることに注意してください。
3. すべての液体窒素がしっかりとキャップでバイアルを閉じる前に蒸発されていることを確認します。溶剤の流出を防ぐためにキャップがゴム製のシールを持っている必要があることに注意して、したがって、均質化中に化合物を抽出した。
4. 30秒のための6000の速度（Precellys用）でFastPrepまたはPrecellysビードのグラインダーのホモジナイザーで組織をホモジナイズ。
5. 個別にホモジナイザーからバイアルを取り外し、慎重にキャップを開き、各試料にジクロロメタンの1mlを加える。しっかりと再びバイアルを閉じて、6000（Precellys）で10 - 15秒のために再度ホモジナイズする。
6. 卓上型遠心機にバイアルに移し、60秒のための10.000xgで水相から有機相を分離。
7. 相分離の後にクリーンな4ミリリットルガラスバイアルに、個々のバ....

ディスカッション

ここで紹介する方法は、化合物のメチル化、サイズおよび化合物の化学的性質が抽出されることを防ぐしないことを提供し、気化をシグナリング植物の広い配列のために確実に動作することが実証されています。また、それは、本明細書に記載されているメチル化法は、誘導体化の唯一の方法ではありません。 Silyllationとアセチル化は、別の方式とプロトコルであり、簡単にオンラインで見つけることができます。

質量分析計は、プロセスからあまりにも多くの不要なイオンを排除するために、実行中に記録されている限定すべき質量範囲を監視する単一イオンに対応していない場合。例えば、ジャスモン酸（JA）とその内部標準ジヒドロジャスモン酸（dhJA）は、2つのメジャー（M ^+1）+イオン、JAのための207と225、およびメタノールと化学イオン化時のdhJAのための209及び227を生成する。これら2つの主要な（M ^+1）+の質量（JA用207、225、dhJAのための209および227は）ので、同じ豊富rationfor JAとdhJAを持っていない、彼らは両方の抽出および定.......