解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

サマリー

アクセス可能なシナプスの電気生理学のアプリケーションでは、シナプス変異体の分析に有用なシナプス活性の定量的な尺度を提供しています。この記事では、神経筋接合部（NMJ）のを公開するために使用される解剖の方法を説明します線虫Caenorhabditis elegans（線虫）と簡潔にこの製剤を適用することができる用途のいくつかについて説明します。

要約

神経伝達は、神経細胞が急速な時間スケールで、彼らのポストシナプスのターゲットに化学信号を介して情報を転送するプロセスです。この複雑なプロセスがリサイクル、分泌小胞、カルシウムセンシング、小胞融合、シナプス後受容体の局在と機能し、最後の適切なシナプス接続、電気信号​​の伝導、標的とプライミングを確保するために多くの事前事後シナプスタンパク質の協調活動が必要ですメカニズム。神経科学者としては、これらの各ステップで機能するタンパク質の解明とその​​作用メカニズムを理解することが、当社の目標です。シナプスからの電気生理学的記録は、シナプス伝達中に発生する基本的な電気的事象から読み出さ定量化を提供しています。分子および遺伝学的ツールの強力な配列とCのシナプスタンパク質を操作するために利用可能なこの手法を組み合わせることにより、 elegansは 、我々はシナプス伝達の結果として得られる機能的な変化を分析することができます。

C.虫は、運動ニューロンと体壁の筋肉のコントロールの移動、これらのシナプス¹のため、まとまりのない運動器官の表現型（UNCのとして知られている）を持つ変異体がしばしば乱すシナプス伝達の間に形成さNMJs。 UNCの変異体は、細菌の食物源の豊富な供給を維持しているので、彼らは食物を摂取するために、いくつかの咽頭のポンプ機能を維持する限り、実行可能なままです。この、一緒に事実とそのC.虫は雌雄同体として存在し、それらは精巧な交尾行動を必要とせずに変異子孫に渡すことができます。ワームから記録するために我々の最近の能力と相まって、これらの属性は^、2,3,7はこの方法UNC変異体の影響の神経伝達を正確に対処するための優れたモデル生物行うNMJs。

解剖の方法は、NMJsを公開するワームの表皮に切開を行うために、シアノアクリル接着剤を使用して、成虫を固定化する伴います。 C.以来、 虫の大人は、解剖は解剖顕微鏡を使用して実行し、優れた手と目のコーディネーションを必要とされる長さはわずか1 mmである。 NMJの録音は全細胞の個々の体壁筋細胞と神経伝達物質の放出をクランプ電圧は、電気刺激、光活性化チャネルロドプシンを介する脱分極⁴となるすべてが高浸透圧生理食塩水、を含む刺激のさまざまなプロトコルを使用して誘発することができることによって作られています簡単に説明します。

プロトコル

解剖のために使用するツールのA.の準備。

1. 解剖/録音室：私たちは通常、22 mmの直径の円形カバーガラスを十分に収容できる大きさであることを中心にドリルで丸穴で、1 / ¹⁶インチの磁性シートから私たちの記録室を構築する。チャンバーの外側の寸法は、レコーディングを行うために使用される顕微鏡のステージに依存します。磁性シートの裏面に、私たちはカバーの各隅に低い溶融Paraplax組織埋め込むワックスのペレットを配置することにより、チャンバーに付着する48 × 60 mmのカバースリップを、添付ガラスとチャンバーの間に挟まスリップ。それは連続的な層の接着チャンバーにカバースリップを形成するまでワックスは、その後、ガラス板を上に向けて、ホットプレート上で溶融する。ワックスはすぐに溶けて、このステップは放置しないでください。チャンバーは削除と同時にワックスが溶けているように冷却する必要があります。 22ミリメートルの円形空洞の内側の縁に沿ってseepedている過剰なワックスは、かみそりの刃のエッジを使用して削除できます。
2. Sylgardコーティングされたカバースリップ：解剖が22ミリメートル、録音室の円形の空洞内に配置されているSylgardコーティングしたカバースリップ上で実行されている。 Sylgardのコートは、シアノアクリル接着剤がダウンしてもワームがそれが差し込まになったときに接着剤ピペットチップをバックブレークするクッションとして機能するときに接着スリップカバーに付着することができます。 Sylgardは（10重量部硬化剤1部に対して、シリコーンベース）の指示を製造するにしたがって、新鮮で構成されています。 Sylgardの小滴は、各カバースリップ上に配置され、さらに表面を作るためにかみそりの刃のエッジを使用して全体に染みています。コー​​ティングされたカバースリップは、大型フラットふた付きの容器に入れて治すために一晩65℃程度のオーブンに残されます。
3. ピペットは：一般的に、我々は、電極プラーを使用して、筋肉からキューティクルの切開と記録を作成、接着ワーム用ピペットを生成するために同じ1ミリメートル、外径のフィラメントホウケイ酸ガラスを使用してください。この段階では、ピペットのいくつかの迅速な交換を必要とすることができるように解剖を試みる前に、ピペットのjarファイルをプルすることをお勧めします。
4. グルーアプリケーター：接着剤は口圧によって、接着剤のピペットの先端からロードして適用されます。接着のピペットは、ピペットのガラス（通常1 mm）の外径と一致する内径を有するポリエチレンチューブの2フィートピースの一端に挿入されます。チューブのもう一方の端は、マウスピースとして機能するエッペンドルフピペットの先端を保持しています。
5. 抽出ピペット：キューティクルの切開が行われた後、ワームの内臓は、ワームの空洞から削除する必要があります。これは、接着剤の塗布に似ていますが、この場合にはガラスの抽出ピペットチップが戻って十分に卵と内臓は簡単にワームの空洞の外バキュームを可能にするために切断されるエッペンドルフピペットの先端に取り付けられたチューブの部分で達成されます。

B.解剖

1. 録音室で円形のワックスペンラインは、Sylgardコーティングされたカバースリップを所定の位置に確実に押されているチャンバー（Sylgard -コートが上を向いて）の境界に近い描画されます。このワックスのラインは、カバースリップを固定化し、下に浸透し、解剖し、記録中にカバースリップを外れからレコーディングソリューションを防ぎます。チャンバーは、細胞外記録液で満たされているといくつかのワームは、ワームのピックを使って中央に配置されます。ワームは、溶液中で泳ぐだろう、しかし練習と、これらのワームは、このような動きを防ぐために冷却するように、それ以上の手続きなしでダウン接着することができます。トレーニングの段階では、それは水泳が損なわれている接着変異体ワームを（そのようなUNC - 31変異体のような）練習することができます。
2. ワックスや粘土で開催されたPCRのキャップから作ら接着剤の容器は、シアノアクリル接着剤の作業用ストックを保持するために使用されます。記録ピペット（通常は〜4メグオームの抵抗）と同様の先端寸法と接着剤のピペットは、接着剤を適用するために使用されます。グルーアプリケーターを用いて、接着剤の少量の接着剤が吸い取られるようにピペットチップを可視化するために解剖スコープを使用して、接着剤のピペットに吸い上げています。
3. シアノアクリル接着剤（HistoacrylBlue、Aesulap）は細胞外記録液と接触すると重合する、従ってそれが硬化から接着剤を防止し、ピペットを差し込むためにチャンバー液に入ると接着剤のピペットで正圧を維持することが重要です。とすぐに接着剤をピペットでチャンバーの溶液中にあるように、接着剤の小さいながらも一定の流れが閉塞を防ぐために口圧力制御下にSylgardの表面に適用する必要があります。ピペットがなった場合、それが時には優しくsylgardコーティングされたガラスに関するヒントをタップしてブロックを解除することができるプラグイン。それは、接着剤のワームを試みる前に、接着を実践することをお勧めします。あなたが日常的にワームの幅よりも細い線で作られた文字で、Sylgard上で接着剤で自分の名前を書くことができるなら、procの準備が整いました接着ワームの表皮にEED。
4. 接着剤ワームをするために、頭部やワームのテールのどちらかに接着剤の少量を添付するために正圧を使用し、急速にSylgardの表面にワームを描く。エッジに近すぎる接着ワームは、記録ピペットで到達が難しくなるのでチャンバーの中心近くにワームを添付してみてください。その後、（腹側筋肉の録音のための）内側に面した外陰部とC -位置にワームを強制的に、開始、添付ファイルからワームのキューティクルの背側縁に沿って接着剤の一定のストリームを適用する。この接着剤の行の任意のギャップは、ワームが強くキューティクル切開のステップ中に切り離すことは、ワームを防ぐために、接続されているので、入力されているはずです。
5. キューティクル切開を行うには、ハンドヘルド解剖のピペットに切り替えます。このピペットは、接着剤/録音ピペットよりもシャープになると短く、頑丈なシャフトを持っている必要があります。解剖範囲で最高倍率を使用して、ワームの縦軸にピペットを平行に整列し、キューティクル/接着剤界面での切開を行うワーム（近くに外陰部に）に沿って中間点に関するヒントを挿入する。この切開は、切開のポイントを介して卵と腸を強制的にワームの静水圧を解放します。あなたが咽頭に到達するまで、手紙を開くために同様のスライス動きでワームの頭に向かってキューティクルを切断続ける。ワームの内臓を真空抽出ピペットに切り替える。切開をクリアした後、開いたキューティクルは、その円筒状の形状を保持します。 Sylgardの表面にクチクラの切り口を下に溶接見つけるために新鮮な接着のピペットを使用してください。 NMJsを損傷または不明瞭にしないため、この段階で最小限の接着剤スポットを使用することが重要です。
   腹側神経索と体壁の筋肉は、現在公開されています。
6. 、NMJsを覆う基底膜を除去チャンバーから細胞外記録のソリューションを吸うと、約10-20秒間コラゲナーゼを（細胞外記録液の0.4mg/ml）に適用するには、削除して、新鮮な細胞外記録液で数回洗浄する。録音の段階に進みます。

C.パッチクランプ記録

1. 中央ワームのに10倍対物レンズを用いてまで右顕微鏡のステージ上の記録室を置きます。 DICと40Xの水出現の目標に切り替え、体壁の筋肉と神経索が完全な状態であることを確認してください。ワームの縦軸は電極が左右両側から導入できるように、範囲の前縁と平行になるようにワームを配置します。
2. 標準的なパッチクランプ技術を使用して筋肉にパッチを適用します。約4メグオームの抵抗の記録電極が適しています。電極は、筋肉の膜に触れた後gigohmシールが得られるまで、負圧を増加させる。ホールセル電圧クランプ記録モードの場合は、より多くの吸引を適用し、gigohmシールが破裂するまで膜を攻撃する。良い録音では、野生型の成虫の体壁の筋肉は、通常、約70 pFの細胞膜の静電容量を持っているし、安定的に最小限の保持電流（〜50 -60 mVの保持電位で少なくとも10分間記録することができますPA）。
3. 塩化ナトリウム150、KClの5、CaCl _2の 5、MgCl _2の 4、グルコース10、ショ糖5、HEPES 15（pHは7.3、〜330mOsm）：細胞外記録のソリューションは、（mm）で構成されています。パッチピペットは（mMで）含まれています：KClを120、KOH 20、MgCl _2の 4、（N -トリス[ヒドロキシメチル] mthyl -2 -アミノエタン-スルホン酸）TES 5、二水和物CaCl _2で 0.25、硫酸_{ナトリウム} ATP 4、ショ糖36 、EGTA 5（pHは7.2、〜312 mOsm）。注：これらのソリューションは、人工的にGABA受容体を介した電流は-60 mVの保持電位で塩素流出による内側になるように、塩化物と筋肉細胞を読み込むこれらのソリューションのバリエーション（詳細については出版物を参照）が使用されている。
4. リリースを誘発。一般的に我々は、パッチを適用した筋肉の前腹側神経索の細胞外溶液を含む第二の電極を配置する。この緩やかなパッチの構成は、野生型ワームで最大の誘発反応（通常は2.0から2.5 NA）を達成するために短期間の大規模な脱分極刺激（ボルトの10秒のオーダー）（1 - 2msの）が必要です。このアプローチの限界は、1）神経索が不可逆的に損傷し、2する前に、ほんの数誘発反応が理由は不明）に配信することができる、唯一のコリン作動性誘発反応は、この刺激の構成を使用して誘発することができます。
5. 光は、チャネルロドプシンの刺激を活性化。最近、ゴットシャルクのラボでは、式^4を駆動するために使用されるプロモーターに応じて、神経細胞のサブセットで、光刺激により細胞膜を脱分極藻類由来のチャネルロドプシンを発現するトランスジェニックワームが生成されています。 Cの場合で虫 NMJ、どちらかのコリン作動性運動ニューロンやGABA作動性運動ニューロンにチャネルロドプシンを発現している統合された行が現在availablですE.チャネルロドプシンのみが全トランスレチナールはオプシン部分に関連付けられているとき点灯に応答するので、このアプリケーションで使用するワームは、網膜が混入細菌上に成長されている必要があります。緑色の光パルスは、繰り返しtransgenicワームが使用されているかによって、アセチルコリンやGABAのどちらかの誘発放出をcausing channelロドプシンをアクティブにすることができます。これらのトランスジェニックワームは、変異株に交差することができます。前の電気刺激に対するこの手法の利点は次のとおり、1）光活性化はGABA作動性またはコリン作動性運動ニューロンは独立して調査することができるのいずれかからリリースを誘発）、多くの繰り返しの刺激を行うと2できるように、神経損傷を引き起こすことはありません。
6. 高浸透圧誘発性放出。容易に放出可能小胞プール（記録された筋肉の上にすべてのNMJのからプライミング小胞の合計プールを反映する）の大きさを測定するために、高浸透圧、細胞外溶液の入った圧力ピペットは（追加のショ糖を添加することにより〜850 mOsmに調整）に使用されます。 1-3秒の圧力パルスのアプリケーションでは、上記の標準液を使用して非同期のポストシナプスのイベントの弾幕を生成する。

図1：Cの回路図の概要elegansの解剖および神経筋録音の設定

ガラスと硬化全体Sylgardのスミアドロップによるsylgardコーティングされたカバースリップは、一晩プレハブ記録室の円形の空洞内に配置し、記録液で覆われている。中央に配置されたワームは、接着剤ピペットを用いて、ワームの背側に接着剤を適用し、先頭または末尾から開始Sylgard表面に糊付けされています。一度接着が完了すると、キューティクルと接着剤間の界面における外陰部に隣接切開は、ガラスの針で行われ、（赤のミシン目を参照）頭に向かって拡張されます。内臓や体腔から卵の抽出に続いて、切開の面取り部は腹側神経（緑）と体壁の筋肉（赤）を公開するSylgardに接着剤でスポット溶接されている。外陰部の前腹側、内側の筋肉は、パッチクランプされ、刺激電極は、神経索に上流に配置されます。

代表的な結果

全細胞、電圧クランプ体壁筋の録音は、（電気的に誘発、光誘発し、高浸透圧応答）上記の3つの刺激の各プロトコルに示されている。すべてのケースでは腹側内側体壁筋を-60 mVにクランプされます。 A.野生型筋細胞は、通常、私たちの標準的なレコーディングソリューションで内因性の内向きの小型のシナプス電流の高い率を示す。 B.前腹側神経索の2msの脱分極は、野生型ワームで2〜2.5前後nAの大きな誘発反応で生じるいくつかのシナプスからの同期放出を引き起こします。 AとBの野生型のトレースの右側にある代表的なトレースがひどくまとまりのない変異体（UNC - 18）におけるシナプス放出を示す。パネルCは、コリン作動性ニューロンにおけるチャネルロドプシンを発現する野生型ワームの神経筋接合部からの光誘発反応を示しています。 2msの光パルスは、通常、1.5〜1.8 nAの応答を生成します。 D. 1秒のための筋肉の上に850 mOsm高浸透圧の生理食塩水圧力放出は、小胞の容易に放出可能プールを表すミニチュアシナプス電流の非同期弾幕を生成します。

ディスカッション

遺伝的モデル生物C、elegansのは理想的にシナプスのタンパク質をコードする遺伝子の変異の機能解析を通じて、シナプス伝達の研究に適しています。ここではCをレンダリングする解剖手法を記載している虫は、電気生理学的解析のためにアクセスNMJs。付属のビデオは 、C言語の重要な手順を示していますelegansの解剖とシナプス活性を測定するために用いられる代表的な録音の設定。このテクニックを学ぶことに最大の課題を提起三つのステップとしては、1）ワームの接着のステップ、2）成功した​​切開を行う、と体壁の筋肉への3）パッチ。これらをマスターしたら、この準備は、電圧クランプや電流クランプモードでのポストシナプス筋の録音に適している。誘発刺激に対する応答は、容易に変異さまざまな経歴でこの解剖の準備を用いて測定することができます。野生型成体のワーム（長さは1 mm）をすでに分サイズを考えると、成人に達するか、または骨張った残っていないシナプスの変異体は、この解剖のアプローチに従順になる場合があります。いくつかのラボが正常にCから記録されているも...