方法論記事

レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用

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DOI：

10.3791/1258

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2009年6月1日

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1The Second Teaching Hospital of Jilin University, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

レンズ開発は、他の組織との相互作用を伴います。いくつかのゼブラフィッシュの眼の変異体が異常に小さいレンズの大きさによって特徴付けられる。ここでは、この表現型は、レンズを囲む組織との本質的な原因や欠陥の相互作用によるものかどうかを判断するためにレンズの移植実験を示しています。

要約

レンズは、眼杯[1,2]の開発において重要な役割を果たしている。モデル生物としてゼブラフィッシュを用いて、レンズの開発についての質問に対処することができます。ゼブラフィッシュは、小型サイズ、高い繁殖力、短いライフサイクル、およびケアの容易さなど、いくつかの有利な特性に起因する遺伝学的研究に有用です。レンズの開発は、ゼブラフィッシュで急速に発生します。 72 HPFにより、ゼブラフィッシュのレンズは、機能的に成熟している[3]。豊富な遺伝と分子資源は、ゼブラフィッシュの研究をサポートするために用意されています。さらに、他の脊椎動物のものとゼブラフィッシュアイの類似性は、人間の欠陥の優れた動物モデルとしての使用（4）〜（7）の基準を提供します。いくつかのゼブラフィッシュの突然変異体は、いくつかのケースでは、レンズティッシュ[8]の完全な変性につながる細胞死、の高いレベルを含む、レンズの異常を示す。

レンズの異常は、本質的な原因または周囲の組織と欠陥の相互作用によるものかどうか判断するために、野生型の目に変異体レンズの移植が行われている。ファイアーポリッシュ金属針を使用して、変異体または野生型レンズは、慎重にドナー動物から解剖し、ホストに転送されます。野生型と変異体の組織を区別するために、トランスジェニック系統をドナーとして使用されます。この行は、レンズを含めて、全ての組織において膜結合型GFPを発現する。この移植法は、ゼブラフィッシュレンズの変異体の研究に不可欠なツールです。

プロトコル

パート1：胚を準備

このプロトコルでは架空ゼブラフィッシュレンズ変異を示すためJJ なxyシンボルを使用します。

  1. ゼブラフィッシュ株は14H light/10h暗サイクル28.5 Cで標準魚ファシリティ条件で維持さ。
  2. 夕方、場所雄とゼブラフィッシュひずみJJ xyの雌における：AB / TU;互いにからそれらを分離するデバイダ持つタンクにおけるTG（MGFP）。この十字架の子孫はすべて組織におけるGFP導入遺伝子を発現するであろう、およびドナーとして使われます。パラレルで、非トランスジェニック野生型動物間交雑をセットアップする同じ手順を使用。この実験の目的に応じ、一つドナーまたはホストとしてJJ なxy座で野生型動物を交差できます。
  3. 光が朝でターンオン後1時間以内、メイトへ魚を許可する仕切りを取り外します。
  4. 15-30分間が100 × 15ミリメートルシャーレで胚を収集後、それらを掃除、と培地（卵水を）変更。
  5. 希望時間まで28.5 Cインキュベーターで胚キープ。
  6. するとき移植用準備、鋭い鉗子の二対で手動絨毛膜を取り外し、および30分間カルシウム-フリーZFRで0.2％EDTAで胚をインキュベート。

パート2：解剖針の調製

  1. ;とドナーレンズを移動とホストに挿入する使わ鈍針、レンズを取り巻く組織をカット絨毛膜を削除、およびアガロースからリリース胚に使われる尖った一つ：移植手順は針の二種類を必要。ここではこれら針を作る方法を紹介します。
  2. 最初、パスツールピペットの先端はダイヤモンドナイフを使っ断たれるなりません。その後その長の約半分がそれ内側なるようパスツールピペットチップにキャピラリーガラスを挿入。これは容易次ステップでガラスにそれを溶融によってタングステンワイヤを動けなくする行います。
  3. その後キャピラリーの開口端に細いタングステン線を挿入。ブンゼンバーナーとともにワイヤーにわたってガラスをメルト。手で針の他端をねじれながら鉗子を使用、金属線とともに着実ガラス終わりをホールド。軟化したガラスは場所にを把持金属周りスパイラルすべき。
  4. もし鈍先端針を作っている場合、このは手順の終わりです。シャープ針を作成する、非常細かい先端が作成れるよう金属をオフ燃焼、1から1.5分間ブンゼンバーナーにわたってタングステンワイヤーをホールド。 microscropy.Itによって先端の品質が移植前直ちに数秒間火炎における両方針の滅菌に良いアイデアですチェック。

パート3：試薬の調製

  1. カルシウム-フリーゼブラフィッシュリンゲル（ZFR）ソリューションズ（116 mMのNaCl、2.9 mMののKCl、5mMのHEPES、pH7.2を）
  2. カルシウム-フリーゼブラリンゲルソリューション（液pH7.2）における0.2％EDTA
  3. カルシウム-フリーZFRにおける1.2％アガロース（低融点）
  4. カルシウム-フリーZFRの0.2％アガロース（低融点）
  5. リットルあたり胚培地は（pH7.0の、含ま：10ミリリットルハンクスソリューション＃1、1ミリリットルハンクスソリューション＃2、10ミリリットルハンクスソリューション＃4、10ミリリットルハンクスソリューション＃5、0.35 gの重炭酸ナトリウム、2M塩酸の300 UL、ペニシリン-ストレプトマイシン500,000をゼブラフィッシュブック （オレゴンプレス大学、2000）におけるとしてU）。
  6. タングステンワイヤー、金メッキ、0.1ミリメートル直径、アルファAesar
  7. 毛細管、1.0ミリメートル直径、世界プレシジョンインスツルメンツ

パート4：移植手続き

  1. プラスチック遠心管に、水浴40 Cに予熱カルシウム-フリーZFRで1.2％低融点アガロースを準備。
  2. 希望ステージ（例えば30 HPF、）で、ゆっくり遠心管にそれらを追放、およびゆっくり遠心管にそれらを追放と約5秒間インキュベート、パスツールピペットで胚を占有。ドナーとホストは別途インキュベートれるべき。
  3. ホストとドナーが別個保つ、ピペットとともに、遠沈管から​​1.2％アガロースで胚を占有と100ミリメートルポリスチレンシャーレ内二つの平行行でそれらを手配。ゆっくりと注意深くそれらをペッティングによって、最も胚はアガロースにおける彼ら両側にうそなります。あなたはアガロースが固化前眼が上向きれるよう鈍針を使っこの位置にうそしないもの向きを変更する必要が。
  4. 固化に1.2％アガロースを待ちます、および、0.2％低融点アガロース溶液でそれをオーバーレイ。
  5. シャープ針を使用、目の周りいかなるアガロースを取り外し、および非常注意深く小さなストロークを使っホストとドナー胚からレンズを切り取る。ようそれを引き裂くはなくレンズするちょうど十分近いカットする必ず確認、ならずのでホスト眼の残りからすぎる組織を削除しない。
  6. かつてフリー、レンズは培地でフロートします。鈍針を使用、注意深くドナーをプッシュレンズは、単にホストのレンズが正常になる場所の位置の上にして、鈍針で目の中に、押し下げてください。ホストのレンズは破棄されることがあります。
  7. 30〜60分間、1.2％アガロースでドナーとホスト胚のままにして、鋭い針を用いてアガロースからそれらを解放し、胚の培地で24ウェルプレートにそれらを転送する。それぞれの胚には、別々の井戸を占有する必要があります。正しくので、ホストがどのドナーに対応するかを明確であることを井戸にラベルを付けることを確認してください。
  8. 28.5℃でインキュベートするドナー由来のレンズは、GFP蛍光に基づいて、同じ動物の逃れた側のホストのレンズと区別することができる。セクションはまた、レンズのサイズを測定するために、それが適切に区別するかどうかを判断するために行うことができます。

figure-protocol-1
図。レンズ移植のために使用されて削られた針の1低倍率画像。キャピラリーガラス（B）は、パスツールピペット（A）に挿入され、細いタングステンワイヤ（C）は、キャピラリーの開放端に挿入されます。ワイヤー上のガラスは、ブンゼンバーナーで柔らかくします。あなたの手でパスツールピペットのもう一方の端をねじりながら、鉗子を用いて、金属線で安定したガラスの端を保持する。軟化したガラスは、金属の周りスパイラル、所定の位置に把持すべき。


figure-protocol-2
図。レンズ移植のために使用される注射針の二種類の2のヒント。


figure-protocol-3
図。 3胚は30hpfでレンズ移植を施行した。示すように、ドナー胚（A、B）、移植レンズ（C、D）、およびホスト胚（E、F）の制御側でのホストの目です。示されるように各眼は透過光およびUV照射の両方で表示されます。写真は48 HPFで撮影したもの。 Q01 [9]トランスジェニックラインは、この実験に用いた。

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ディスカッション

いくつかのステップは、レンズの移植中に特別な注意が必要です。

  1. 針の先鋭化：これは、レンズの移植を実施する前にいくつかの針を準備すると良いでしょう、と針の先端はできるだけ薄くする必要があります。厚い針を癒すために目に障害を引き起こし、ためにより広い直径のより多くの組織を引き裂くだろう。
  2. 胚の配置：彼らが両側に横たわっているように右移植前に胚を配置する必要があります。配置する際、1.2％アガロースで固化は、非常に迅速にできます。アガロースの硬化を遅くするために、ペトリ皿は、それが40 ° Cの水浴中で浮いせることにより予熱することができます。
  3. ホストの目にドナーのレンズを挿入する前に、可能な限りホストの頭の周りなど、多くのアガロースを削除するようにしてください。それは、ドナーのレンズをそのように挿入する方が簡単です。
  4. ちょうどレンズ移植後の胚を0.2％アガロースの層で覆われ、1.2％アガロースの層に埋め込まれたままにしておく必要があります。抗生物質で胚のメディアを追加すると、ドナーとホスト胚の両方で創傷治癒を促進する。アガロースから胚をリリースする前に、30〜60...

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謝辞

この手順では、ビルジェフリーの研究室で洞窟の魚のために開発された大部分は移植技術に従います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
直径0.1mmタングステン線A Johnson Matthey45086
アガロース（低融点）Sigma-Aldrich39346
ホウケイ酸ガラスキャピラリーWorld Precision Instruments, Inc.TW 100-4
ピンセットDumont11252-30
パステールピペットFisher Scientific13-678-20C
ピペットポンプFisher Scientific13-683C
シャーレCardinal HealthD1906
ペニシリン-ストレプトマイシンGIBCO, by Life Technologies15140-122

参考文献

  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
  2. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
  3. Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
  4. Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
  5. Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
  6. Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
  7. Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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