脳の銀行と生体物質の系統的サンプリングは、公平な立体学の基礎を提供し、各試料から得られる潜在的なデータを最大限に高めることができます。
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この記事について
サマリー
要約
公平な立体学が正確かつ効率的に関心のある一定の領域で合計ニューロンの数を（または他の細胞型）を推定するための方法です。
プロトコル
パート1：組織の前処理
- 組織はよくパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。これは通常、他の臓器を収穫するために使用される標準transcardial灌流によって達成することができます。本研究では被験者は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静したペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流。これは、5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液が続いている。
- 脳は、定位、ブロック頭蓋骨から削除、秤量し、ボリュームは2を決定する必要があります。組織は、その後リン酸緩衝液で30％のショ糖の最終濃度に段階的スクロース溶液で凍結保護されるべきである。組織のブロックがその後-65 ° Cでイソペンタンで凍結し、-80で保存してください° C、スライスする準備が整うまで。
パート2：システマティックサンプリング
- 系統的サンプリングは、前の切片に適切な計画に依存しています。吻側 - 尾と背腹のエクステントの両方に関心の全領域は明確に定義されるべきである。使用中の種の脳地図は、関心領域を定義し、関心領域の長さを決定しておくと便利です。かつて関心領域の長さは、それがサンプリング間隔を確立する必要がある決定されます。例えば、脳地図からあなたは、冠状面でのセクショニング時に関心領域の全体rostro -尾程度の長さが約3mmであると判断する。次に、50μmの時にセクションにクライオスタットを設定するには、このレートでは関心領域の吻側 - 尾程度をカバーする60のセクションを持って決める。典型的な立体的研究のために60から10まで体系的にサンプリングされたセクションは、信頼できる結果を得るために必要とされています。この例では10のセクションでは、均等に6分の1のセクションのサンプリング間隔でrostro -尾程度の結果全体に等間隔。
パート3：脳バンクの作成
- 節のサンプリング周波数が決定されると、次のステップは汚れがすぐに実行されるかを決定することです。たとえば、クレシルバイオレットで染色している場合には、スライドの1 / 6つのセクションをキャプチャします。これはシリーズ1になります。あなたはそこにあなたが実行したいが、どちらをプライマリ染み提供するデータを参照するか、単に免疫組織化学を実行する時間を持っていない、彼らはその順序でセクションの残りの5シリーズを配置することかもしれないいくつかの潜在的な抗体を知っていれば抗原保護区域 （1％ポリビニルピロリドン、o.1M PBS、pH7.4中50％エチレングリコール）を含むウェルにスライスされた。下の表は、1スライドと脳バンク（表1）の一環として、セクションの1枚（標準48ウェルプレート）で構成されるサンプリング方式を提供します。
表1ここにセクションのサンプリング周波数は1 / 6です。最初のセクションは、クレシルバイオレット染色用スライド上に配置され、次の5つのセクションが保持する抗原に配置されます。セクションの番号7は、スライド上に捕獲され、セクションは、9月12日維持抗原に配置されます。組織の利益またはブロックの領域が網羅的に区分されるまで、このサイクルが繰り返されます。 - 次のステップは、徹底的にセクションに組織のブロックです。チャックでメディアを埋め込むの少量を置き、それがフリーズしましょう。ミクロトーム頭にチャックを配置し、平坦な表面を持つように凍結培地を十分に剃り落とす。ミクロトームヘッドとクライオスタット内で平坦な場所からチャックを削除します。チャックでメディアを埋め込む注ぎ、しっかりとチャックを平らに置か定位カット側で脳のブロックを設置。ゆっくりと完全に培地をマウントするに脳を埋め込みます。ミクロトームヘッドと節のサンプリング周波数のためにあらかじめ決められたパラメータを使用してセクションに脳でチャックを置きます。
- 組織のブロックが徹底的に区分されていると節をウェルに配置されると、、蓋でカバープレートをパラフィルムで蓋をラップし、-20℃の冷凍庫内の場所。各シリーズ、セクション、サンプリング間隔、およびそれぞれの動物のための一連の数に要したセクションの合計数をログに記録します。このログは、将来の免疫組織化学のために脳の銀行からセクションのその後の除去を追跡することが重要になります。
パート4：代表的な結果：
この方法で体系的なサンプリングは、過去3年間、私たちの研究室で標準的となっています。我々は、それが信号の劣化（図1）することなくスライスした後三年を維持する抗原に格納されている材料に関する免疫組織化学を行う大きな成功があった。さらに、私たちの脳の銀行の一部として我々は非人間の近い〜20,000体系的セクションを記録している霊長類の脳（図2）当社の長期的な研究計画の一環として。 
図1。NeuNは層VIと間質性白質のニューロンの両方を表示するための免疫染色これは、非ヒト霊長類の後頭極からセクションです。この特定のセクションは、2年間の期間は-20℃で保存する抗原に格納されていました。スケールバー=100μmの。 
図2我 々のベルベット脳の銀行は現在30以上のサルから近いから20,000の体系のセクションで構成されています。
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ディスカッション
系統的サンプリングは、研究材料を最大にするため安価な方法です。このサンプリングの戦略は、地域全体の体系的なサンプリングを必要とする公平な立体学の規則を遵守するように設計されています。それは、シリーズごとのセクションの順序が維持されていることが重要です。私たちのラボでは、正常ハムスターとヒト以外の霊長類の脳の両方のセクションをバンキングのこのメソッドを使用している。これまでのところ、我々は近い〜20,000ベルベットモンキー（Chlorocebus aethiops sabeus）脳切片を収集しており、日常的に一年以上保存されているセクションにimmunohistochemistyを実行します。よく特徴脳の銀行のメリットは、資金調達の意思決定、新しい学生が迅速にデータを収集し、それによって研究資金を最大限に新しい動物の使用と治療を最小限に抑えるための能力の間でデータを収集する可能性が含まれます。
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開示事項
著者に開示すべき事項はありません。
謝辞
著者は、彼の継続的な技術サポートのためにIkiel Ptitoに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エチレングリコール | Fisher Scientific | E178-4 | |
| ポリビニルピロリドン | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific 包埋剤 | Fisher Scientific |
参考文献
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
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