特定の組織型から解離し細胞が組織aggitationのための特定のパラメータは、実行可能な、培養可能な細胞の大量を取得する必要があります。ミルテニーgentleMACS Dissociatorは、シンプルで実用的なプロトコルを使用してこのタスクを最適化します。本書ではnerual組織でこの装置の使用は説明されています。
この記事について
サマリー
要約
神経系の中で、神経細胞およびグリア細胞の数百種類が記載されている。脳または脊髄内の各特定の細胞型は、細胞表面分子、またはそれを特定して特徴付けることができるような分子決定因子、のレパートリーを持っています。現在のところ、堅固な細胞の同定と分離技術は、同時に特徴的な表面タンパク質の細胞死と破壊を制限しながら、生成される単一セルの準備が必要です。抗原のエピトープを保持し、細胞の損失を制限しながら、トリプシンやパパインベースの解離キットと組み合わせて使用されるgentleMACS Dissociatorは、効果的かつ穏やかに脳組織を切り離すことができます。単一の細胞懸濁液の標準化された製剤は、Cチューブと最適化された、プリセットgentleMACSプログラムを使用して実現されます。一度生成された、単細胞懸濁液は、神経前駆細胞を識別する、またはミエリンの除去のビーズを使用してさらに精製した抗プロミニン- 1マイクロビーズのようなモノクローナルコンジュゲートで治療することができます。
プロトコル
無菌条件下で動作するように、それは層流フード内のすべての手順を実行することをお勧めします。
1。材料
- 神経組織解離キット（P）（コンポーネント：解決策1,2、3、4、記憶バッファー）
- プレセパレーションフィルター
- （オプション）ミエリンの除去ビーズ
- β-メルカプトエタノール
- gentleMACS Dissociator
- Cチューブ
- MACSmixチューブローテーター
- HBSS（W / O）
- HBSS（W）
- プロトコルを開始する前に以下のソリューションを準備します。
- 二価カチオンのないハンクスバッファード塩類溶液のCa 2 +又はMg 2 +（HBSS（W / O）
- HBSS、標準、すなわちカルシウム2 +およびMg 2 +（HBSS（W）
- その後のアプリケーションへの関心の抗原エピトープに応じて、パパインベースの神経組織解離キット（P）またはトリプシンベースの神経組織解離キット（T）のどちらかを使用してください。
- 神経組織解離キットから次の解決策を準備します。
- 解決策2：0.067 mMのβ-メルカプトエタノールを加える
- ソリューション4：0.7 mlの記憶バッファー（キットに付属）で粉体を溶解、静かに（ボルテックスしないでください）ミックス
- 酵素ミックス1：Cチューブと10〜15分間インキュベートピペット1.9mLの溶液2と50μlの溶液1（キットからの両方）で37℃これは、脳組織の400mgを解離するのに十分です。
2。神経組織を解離
- 1 mlのHBSSを（W / O）を含むチューブで脳組織を秤量
- 予熱酵素ミックス1 1950μLを含むCチューブにマウスの脳を転送する。 （注：このプロトコルは≤400 mgのために書かれていますが、ソリューションのボリュームがCチューブあたりの脳組織の1600 mgまで対応するようにスケーリングすることができます）
- gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_01"にCチューブを置きます。
- 37℃で15分間回転（MACSmixチューブローテーターを用いて、4回転）でインキュベート℃に
- gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_02"にCチューブを置きます。
- 解離のステップの間に静かに解決策3とソリューション4を10μl20μlを混合することによって組織の400 mg当たりの酵素ミックス2の30μlを用意する。
- セプタムシールキャップを介してCチューブに酵素ミックス2を添加し、ボルテックスすることなく静かに混ぜる。
- 37℃で10分間回転でCチューブをインキュベートしますインキュベーターでC。
- gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_03"にCチューブを置きます。
- 37℃で10分間回転でCチューブをインキュベートしますインキュベーターでC。
- チューブの下部に表示されているサンプルを収集するためにスピンダウンする。
3。ろ過
- 目的の細胞への通過を許可するフィルタが十分な大きさを選択します。例えば、プルキンエ細胞が30μmのフィルターを通過するには大きすぎるが、プロミニン- 1 +細胞はなります。
- 細胞を除去するsuitable1000μlをピペットを使用するには、セプタムシールキャップを介してCチューブを形成し、15 mlのコレクションチューブにプレセパレーションフィルターに適用します。 （注：より大きなサンプルサイズが50 mlのコレクションチューブを使用するため）。
- HBSS（w）の10mlでフィルターを洗浄してください。
- 室温で10分間、300 xgでフィルタリングされた細胞を遠心分離します。
- その後のアプリケーションのための選択のあなたの培地または緩衝液の上澄みを再懸濁します。
- ミエリンの残骸を削除するには、ミエリンの除去のビーズを使用してください。
4。代表的な結果：図1-3を参照してください
図。 gentleMACS Dissociatorと1脳の解離は、フローサイトメトリー解析で示すように、97％生存細胞をもたらした。
図。ニューロスフェア形成の2ライト顕微鏡画像は、磁気細胞選別後MACSでの栽培の7日後に抗プロミニン- 1 MicroBeadsを使用して® NeuroMediumはMACSサプリメントB27 PLUSで補足。細胞は、神経組織解離キット（P）を使用して、CD1マウスの脳（P3）から調製した。
図。単細胞懸濁液の3ミエリンの破片は、かなりの細胞分離を損なう、とミエリンの除去ビーズによるミエリン破片の除去は、効率の細胞分離を向上させます。抗プロミニン- 1 MicroBeadsを用いてMACS分離のために、P22マウス脳では神経組織解離キット（P）を用いて解離。単一細胞の懸濁液からの細胞を直接分離のために使用された、またはミエリン削除ビーズを使用して枯渇してミエリンに提出された。ミエリンの除去なしとの試料からの分離を比較すると、純度が以前のミエリンの除去と試料のために高いことを示しています。
ディスカッション
gentleMACS Dissociatorは閉鎖系での神経組織から単細胞懸濁液の標準化の準備を容易にします。神経組織の解離のキットはimmunostainingsと免疫磁気細胞分離1から5のような、さらにアプリケーションに必要な抗原のエピトープを保持するために最適化されています。このプロトコルでは、97％生存細胞に降伏、gentleMACS Dissociatorと神経組織解離キット（P）を使用してマウスの脳の穏やかな酵素的解離を示す。宿主組織の年齢に応じて、5 × 10 6と1 × 10 7細胞、間に神経組織の収量100 mgの。標的プロミニン- 1 +細胞は、抗プロミニン- 1 MicroBeadsを用いて単離し、その後、文化に取り込まれた。プロトコルは、マウス> P7由来の神経組織で作業するときミエリン除去ビーズの追加使用でさらに効果的であることが示されている。
開示事項
著者らは、ミルテニーバイオテク社、ドイツの従業員です。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Cチューブ | Miltenyi Biotec | 製品番号 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| gentleMACS™ スターターキット | Miltenyi Biotec | 製品番号 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| MACSmix™ チューブローテーター | Miltenyi Biotec | 製品番号 130-090-753 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
| 神経組織解離キット (P) | Miltenyi Biotec | 製品番号 130-092-628 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| 分離前フィルター | Miltenyi Biotec | 注文番号 130-041-407 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx |
| Anti-Prominin-1 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 注文番号 130-092-333 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx |
| Anti-Prominin-1-APC | Miltenyi Biotec | 製品番号 130-092-335 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx |
| Myelin Removal Beads | Miltenyi Biotec | 注文番号 130-094-544 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx |
| Art 1000 Reach ピペットチップ | Molecular BioProducts | 注文番号 2079 | http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<無菌条件下で作業するため、すべての工程をラミナーフローフード内で行うことを推奨します。 1. 材料 Neural Tissue Dissociation Kit (P)（構成品：溶液1、2、3、4、ストレージバッファー） 分離前フィルター（オプション） Myelin Removal Beads gentleMACS Dissociator Cチューブ MACSmixチューブローテーター HBSS (w/o) HBSS (w) プロトコルを開始する前に、以下の溶液を調製します。 二価陽イオン（Ca2+またはMg2+）を含まないハンクス平衡塩類溶液（HBSS (w/o)） 標準的なHBSS（Ca2+およびMg2+を含む、HBSS (w)） 後続のアプリケーションで目的とする抗原エピトープに応じて、パパインベースのNeural Tissue Dissociation Kit (P)またはトリプシンベースのNeural Tissue Dissociation Kit (T)のいずれかを使用します。 Neural Tissue Dissociation Kitを用いて以下の溶液を調製します。 溶液2：β-メルカプトエタノールを添加し、最終濃度を0.067 mMにする。 溶液4：粉末を0.7 mlのストレージバッファー（キットに付属）に溶解し、緩やかに混合する（ボルテックス不可）。 Enzyme Mix 1：Cチューブに溶液2を1.9 mL、溶液1（いずれもキットのもの）を50 μl分注し、37 °Cで10～15分間インキュベートする。これで400 mgの脳組織を解離させるのに十分な量となる。 2. 神経組織の解離 1 mlのHBSS (w/o)を含むチューブ内で脳組織の重量を量る。 マウスの脳を、予め加温した1950 μLのEnzyme Mix 1が入ったCチューブに移す。（注：本プロトコルは400 mg以下を対象に記載しているが、溶液量はCチューブ1本あたり最大1600 mgの脳組織まで対応できるようスケールアップ可能である） CチューブをgentleMACS Dissociatorに設置し、プログラム「m_brain_01」を実行する。 MACSmixチューブローテーターを用いて、回転（4 rpm）させながら37 °Cで15分間インキュベートする。 CチューブをgentleMACS Dissociatorに設置し、プログラム「m_brain_02」を実行する。 解離ステップの間に、溶液3を20 μlと溶液4を10 μl緩やかに混合し、組織400 mgあたり30 μlのEnzyme Mix 2を調製する。 セプタム付きキャップを介してEnzyme Mix 2をCチューブに加え、ボルテックスせずに緩やかに混合する。 インキュベーター内で、回転させながら37 °Cで10分間インキュベートする。 CチューブをgentleMACS Dissociatorに設置し、プログラム「m_brain_03」を実行する。 インキュベーター内で、回転させながら37 °Cで10分間インキュベートする。 短時間遠心し、サンプルをチューブ底に回収する。 3. ろ過 目的の細胞が通過できる十分な大きさのフィルターを選択する。例えば、プルキンエ細胞は30 μmのフィルターを通過するには大きすぎるが、Prominin-1陽性細胞は通過する。 適切な1000 μlピペットを用いて、セプタム付きキャップからCチューブ内の細胞を回収し、15 ml回収チューブにセットした分離前フィルターに適用する。（注：サンプル量が多い場合は、50 ml回収チューブを使用すること） 10 mlのHBSS (w)でフィルターを洗浄する。 ろ過した細胞を、室温で300 x g、10分間遠心分離する。 上清を、後続のアプリケーションに適した任意の培地またはバッファーで再懸濁する。 髄鞘の破片を除去するには、Myelin Removal Beadsを使用する。 4. 代表的な結果：図1～3を参照 図1：フローサイトメトリー分析の結果、gentleMACS Dissociatorを用いた脳組織の解離により、細胞生存率97%が得られた。 図2：Anti-Prominin-1 MicroBeadsを用いた磁気細胞分離後、MACS Supplement B27 PLUSを添加したMACS® NeuroMediumで7日間培養した後のニューロスフィア形成の光学顕微鏡写真。細胞はNeural Tissue Dissociation Kit (P)を用い、CD1マウスの脳（P3）から調製した。 図3：単一細胞懸濁液中の髄鞘破片は細胞分離を著しく妨げるため、Myelin Removal Beadsによる髄鞘破片の除去は細胞分離効率を向上させる。Anti-Prominin-1 MicroBeadsを用いたMACS分離において、P22マウスの脳をNeural Tissue Dissociation Kit (P)を用いて解離させた。単一細胞懸濁液から得られた細胞を、そのまま分離に使用したものと、Myelin Removal Beadsを用いて髄鞘除去を行ったものと比較したところ、事前に髄鞘除去を行ったサンプルの方が純度が高いことが示された。>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html |
| 神経組織解離キット (T) | Miltenyi Biotec | 製品番号 130-093-231 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| プロピジウムイオダイド溶液 | Miltenyi Biotec | 製品番号 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
参考文献
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