我々は羊の回腸内に"腸のループを"catheterizingのための新しい手術方法を説明します。一度動物は手術から回復し、抗生物質と鎮痛薬をクリアして、複数の治療は、カテーテルを介してループに直接堆積することができます。
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この記事について
サマリー
要約
腸だけでなく、栄養素の吸収に関与している複雑な構造ですが、個人と外界との間のバリアとして機能します。このように、腸は腸内病原体から免疫学的監視と保護の中心的役割を担っています。調査腸の生理学および免疫学は、一般的に実験モデルとしての"腸のループ"を採用しています。これらのループのモデルの大半は、腸の短期（<24時間）の変更を（1-3）勉強以外の回復外科手術です。我々は以前、特にワクチン、アジュバント、およびウイルス（4）への暴露後に羊の腸での長期（<6カ月）免疫学的変化を測定するために回復腸管ループモデルを作成しました。特定の"ループ"に、この手順は、ローカライズされた治療法、私たちは腸のこの領域をサンプリングすることができます。この方法の大きな欠点は、治療を（手術の時、すなわち）管理するための機会の一つのウィンドウです。さらに、腸の粘膜と内腔の内容の両方のサンプルはプロジェクトの終了時に撮影することができます。上記モデルの他の顕著な限界は、外科的操作と必要な術後の対策が（抗生物質と鎮痛剤の例管理）を直接治療自体及び/に影響を与えるか、それによって交絡結果を免疫機能を変更できることです。したがって、我々はループに長期的なカテーテルを挿入することにより、私たちの腸のループのモデルを修正。羊は、プロシージャから完全に回復し、体外カテーテルによる影響を受けません。特に、ループ内でのカテーテルの設置は、私たちは手術中に投与した薬物の手術とクリアランスからの回復と術後期間の後、間隔を長く、複数の治療法を導入することができます。
プロトコル
実験手順：
- すべての楽器は、オートクレーブ滅菌であり、非autoclaveable材料は、10分の最低Germexコールド消毒液で滅菌されています。
- 羊は、アセプロマジン（0.05 mg / kg体重）、グリコピロレート（0.005 mg / kgの）、および酒石酸ブトルファノール（0.2 mg / kg）をIMでの事前薬用であり、15〜20分間放置。
- 首を剃毛し、皮膚外科的にスクラブされています。頸静脈が可視化されると、リドカイン0.1 mlを静脈を介してSCを注入され、カテーテルを静脈に導入し、家畜の識別タグのセメントと2"病院のテープを使用して皮膚に固定されている。手術中に、動物を10 mlを与えられているPlasmalyte 148 / kg / hrの（重力流による）。
- ジアゼパム（0.2 mg / kgの）IVを投与され、そして麻酔はチオペンタールナトリウム（10 mg / kg体重）で誘導される。リドカイン気管内噴霧が声帯に適用され、羊は、手術の期間中（4 L / minの速度で100％O 2で1.5〜2.5パーセント）挿管し、イソフルランで維持されます。
- 動物は、手術中の体温を維持するために加熱されたマットの上に背側横臥位に配置されます。胃管は過度の誇張を防ぐために、第一胃に挿入されます。
- 腹側腹部を剃毛され、皮膚は3つのPrepodyne外科スクラブして手術のために用意されています。腹部は、その手術部位（尾腹部に臍）の適切な露出が維持されることを保証し、ドレープです。
- 15〜20センチメートルの正中切開を尾側に臍から、electroscapelを使用して行われており、回盲ヒダは右下腹部に位置しています。尾回腸と盲腸をして体外されています。手順では、腸の扱いは最小限に抑えられ、体外腸が緩衝生理食塩水暖かい（37〜39℃）滅菌リン酸塩（PBS、pH7.2）で湿った保たれるように注意しています。
- 回腸の85 cmの部分（すなわち、"腸のセグメントは"）を測定して、セグメントの両端にドアイヤン鉗子（腸管クランプ）と大ケリー鉗子でクランプされます。腸のセグメント内で、"ループ"とループとの間の"隙間"が確立されます。ドアイヤンの鉗子は、（吻合）に参加するに回腸の側に配置されている、とケリー鉗子は、回腸の腸セグメント側に配置されます。
- 回腸は各ドアイヤンとケリーforcepの間で切断され、ループのために指定された腸のセグメントは、ゆっくりと摂取物を除去するために暖かいPBS 60mlで二回フラッシュされます。
- 広域抗生物質（200 mgのエンロフロキサシンと温かいPBSで250mgのメトロニダゾール、60ミリリットルの合計体積）のカクテルは、腸のセグメント全体に分散し、30分間放置されています。
- 回腸（小腸のセグメントを除く）の近位および遠位のカットの端は連続して機能的な腸管を形成するために結合されます。最初に、回腸はそれぞれ、小腸の腸間膜とantimesenteric国境に配置され、二つの滞在の縫合して整列されます。その後、単純な連続縫合パターン（2-0 Vicryl）が一緒に腸に参加する腸の両側に完了する。
- 温かいPBS（3-5 ml）を漏洩し、縫合不全をチェックするために吻合の部位に注入される。その後、ケリーforcepの先端が腸の漿膜表面に押し付けられ、吻合部のサイトに近い、と吻合部での高度な内側は、腸の内腔が大きいと特許であることを確認する。
- 抗生物質カクテルは、腸のセグメントから削除されます。 2から0 Vicrylを使用して反転縫合のパターンが続く、セグメントの各端部は、単純連続縫合パターン（2-0 Vicryl吸収性縫合糸）で閉じられます。
- 85センチメートル-長い腸セグメントは3つ15センチメートル"ループ"、ループの間に2つの15 cmの長い"隙間"、と腸セグメントの末端に2つの5 cmの長い平滑末端区画（図1）に分割され。ループは2から0までシルクを使用して腸の周りに字を置くことによって作成されます。それは、これらが腸内生存率を維持し、血液と腸を供給するために必要に応じて主要な腸間膜の血管は、この手順の間に連結していないことは注目に値する。彼らはカテーテルを保護するために使用するとしても、合字は、長い間放置されています。
- カテーテル（すなわちシラスティックチューブ）が個別に永久的なマーカーを使用して識別されます。カテーテルを取り囲むシリコンボール（5 mmの直径）は、腸（図1）からスライドからカテーテルを防ぐために、カテーテルの端から4〜5センチメートルを配置されます。オートクレーブで滅菌した後、非抗生物質軟膏（Orbeseal）は無菌的にカテーテルの端（3-5 mm）の中に挿入され、これはカテーテルが特許に留まることを保証（すなわち、それがループ内で脱落粘膜で詰まるしていません）。
- 小切開は、3つのループの各々の頭蓋の側面に配置されます。各穴は、カテーテルイントロデューサー（すなわち"血管拡張剤"）に拡大され、カテーテルの6-8 cmのセグメントは、中に尾の方に挿入されますループは、silconeボールまで、内腔（図1）に渡します。
- 腸壁は、財布の文字列の縫合糸（2-0 Vicryl）とカテーテルの周囲に固定されています。カテーテルは、さらにループの頭蓋終わりを線引き合字の絹とカテーテルを接続することにより腸に固定されている。
- アンピシリン（5ミリリットル、温かいPBSでは100 mg / ml）を各ループと隙間に注入され、腸が腹腔内に戻されます。セファゾリン（8ミリリットル、温かいPBSでは100 mg / ml）を腹部を切開して腹腔内に注入される。
- 一つの小さな刺し切開は正中切開に隣接して腹壁を介して行われる、とカテーテルはこのサイトを通じて体外されています。
- カテーテルの位置とテンションが腹腔内に調整されます。腹部の筋肉は、単純結節縫合パターン（吸収性縫合糸、腸線＃3）で閉じられ、そして皮膚が中断された水平マットレスパターン（非吸収性縫合糸、Supramid＃1）で閉じられます。
- 曲がった中空ステンレス鋼管（7 mm内径、幅10 mm OD、長さが65 cm）を首にちょうど尾出口部位に皮膚の下と肩の間でトンネリングさ、腹部切開付近の皮膚の下に挿入されます。カテーテルはチューブに挿入し、チューブの長さの少なくとも50％のために進められています。カテーテルとチューブは、カテーテルを公開、出口部の皮膚からプルされます。
- カテーテルの張力を刺すの切開部位に調整され、皮膚はSupramid＃1でクローズされます。
- 個々のカテーテルを同定し、Supramid＃1で皮膚に縫合された包帯"ポーチ"の中に置かれています。ポーチは、その後のダメージからカテーテルを保護します。
- 術後、羊は、初期用量でフルニキシン（SID）を使用してIMを注入されている2.2 mg / kgを、3日間1.1 mg / kgのSIDの維持用量が続く。羊はまた、それぞれ、3および5日間Hemostam（3 ml）およびエンロフロキサシン（2.5 mg / kg）のSIDを使用してIMを注入されています。動物は、そのフロー（145ミリリットル/時間）は関係なく身体の位置のまま継続する蠕動ポンプで連続的に投与した5％ブドウ糖液で静脈内Plasmalyte 148に保持されます。彼らは自由摂取を飲むことを許可されていますが、通常の第一胃と腸の機能が復元されるまで、フィードが制限されています。食物摂取、水の消費量、体温、糞便や尿、腸音、腹部不快感、態度、そして血中グルコース濃度の経過は密接に（入札）を監視され、必要なときに、点滴中のグルコース濃度は血中グルコース濃度を維持するために調整されます正常範囲内。血液化学及び血液学（すなわちアルブミン、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、カルシウム、コレステロール、クレアチニン、グルコース、無機リン酸、総ビリルビン、総蛋白、尿素、グロブリン、ナトリウム、カリウム、塩化カリウム、分圧の酸素、pHは、部分的圧力の二酸化炭素、重炭酸塩、および総二酸化炭素、赤と白血球数、ヘマトクリット、ヘモグロビン、差動白血球数および血小板数）は手術前と直後に監視し、一日おき、その後されています。正常な腸機能が開始されると、静脈内輸液療法が終了し、動物が放牧（すなわち5〜7日後に手術）に転送されます。動物は、それによってストレスとそのカテーテルの袋（例：penmateで噛む）に損傷を受ける可能性を減らすこと、（他の動物の視界内）の個々のペンで維持されています。
- 個々のループに治療を注入するために、治療の5mlを18ゲージ、先の尖っていない針を備えた滅菌注射器を使用してカテーテルに注入されます。ループへの治療のすべての沈着を確保するために、カテーテルをPBS 3mlで注入されます。
臨界点：
この手術の成功に非常に重要な手順は以下のとおり（1）腸の吻合を確立する前に、それ自体にねじれていないことを確認、（2）吻合の整合性と開存性の確保、（3）適切にカテーテルを確保ループループの頭蓋終わりの輪郭を描く合字を持つ壁が、添付ファイルは、カテーテルの開存性に影響しないようにすること、（4）腸のハンドリングを最小限に抑え、体外腸が湿った保たれることを保証するには、（5）適切なカテーテルを確保テンション、（6）カテーテルの整合性が筋肉と皮膚縫合時に影響を受けないようにすること、（7）のルーメン宿便と障害を引き起こす可能性が羊の手術後（術後イレウスの期間中、すなわち）でgorging防止第一胃の機能、動物は、最初の3-5日後に手術のために十分な静脈内輸液療法を受けることを確保すると（8）、その血中グルコース濃度を注意深くモニターして、点滴中のグルコース濃度は、adjusですされていますテッド低血糖を防ぐために、必要に応じて。 
図1。カテーテルを挿入された回腸ループの模式図。注意three 15センチメートルにわたる"ループ"カテーテルを挿入、ループ、および2つの5 cmの長末端セグメントの間に確立された2つの15 cmの長い非カテーテル"隙間"は、全85 cmの長い"腸のセグメント内に設置"羊の回腸の。
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ディスカッション
この手順では、我々が正常に羊の回腸内に確立された腸管ループ内でカテーテルを確立することができた。厳格な術後ケアに従うことで、動物が急速にプロシージャから回復し、5〜7日手術後に正常な活動を再開した。我々は、ループ内カテーテルの設置は、腸粘膜や免疫機能を（データは示さず）には影響しないと動物が手術後、少なくとも8週間のために生きることができることが判明。この手順では、私たちは、かつて動物が手術から回復した、と経験的にこれらの治療法の生理学的および免疫学的影響を測定するために、間隔を長く別個の免疫学的区画に複数の治療を導入することができます。
将来の実験のための重要な考慮事項は、小腸内の腸セグメントの場所です。この手順では、外科的に同じ頻度で回腸（連続）パイエル板（5,6）で定義されている"免疫学的機能的な回腸"内腸セグメントを作成した。このエリアでは、回盲ヒダを超えて頭側で最大2 mを拡張することができます。この領域は空腸と解剖学的に考えられているが、免疫機能のコンテキストで、それは腸の領域を記述するときに、関数を考慮することの重要性を強調し、回腸である。
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開示事項
実験動物のすべての手順は、動物実験委員会によって承認（動物用のプロトコル＃0609）や動物ケアのカナダCouncilによって設定されたガイドラインを追跡した。
我々は、開示に何もない。
謝辞
研究は、献身と農務農産食品カナダ研究センター、レスブリッジ、アルバータ州、カナダで多くの人々の努力なしで完了していない可能性があります。その意味で、我々は感謝：前と術後の動物のケア、手術の準備、そして麻酔、試料の分析、およびビデオ画像処理の支援のためのタラシェルトン、ランディワイルドとエステラコスタリカ前と術後ケアのための;サンプル分析のためのジェニーGusse、トロカールの画像のためのバイロンリー、および羊の飼育のためのブライアンEgland。我々はまた、ビデオ機器やアドバイスだけでなく、その他の援助を（すなわちエグゼクティブ生産）提供するためのブレントSelingerを（生物科学科、レスブリッジ大学）感謝、そしてカリキュラムの再開発センター、ビデオ撮影の専門知識のためのレスブリッジ大学。この研究は、高度な食品材料のネットワーク（GDI）、カナダ - アルバータ州の牛肉産業開発基金（GDI）、および農務農産食品カナダ（GDIとJPK）からの補助金によって部分的にサポートされていました。
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材料
| カテゴリ/アイテム数 | 会社 | カタログ |
| 外科医の供給 | ||
| 手術用手袋 | WDDC | 103091 |
| 手術用マスク | WDDC | MAX53013 |
| 手術衣 | CDMV B | 3365 |
| OBのエプロン | WDDC | 900062 |
| 手術帽 | WDDC | 903271 |
| EZスクラブブラシ | WDDC | BDC377479 |
| 麻酔と麻薬 | ||
| 麻酔器 | ボイル | |
| Sodasorb | WDDC | 108638 |
| 喉頭鏡 | WDDC | |
| 喉頭鏡のブレード（ミラーブレード＃4） | WDDC | 902667 |
| 気管内チューブ（7.0〜8.5ミリメートル） | WDDC | |
| リドカイン気管内噴霧 | WDDC | 103364 |
| アセプロマジン | WDDC | AUS01020 |
| グリコ | WDDC | SAB2880 |
| 酒石酸ブトルファノール | WDDC | AYE304541 |
| ジアゼパム | WDDC | sab790 |
| チオペンタールナトリウム | WDDC | 103508 |
| 塩酸エピネフリン | WDDC | 103856 |
| ドキサプラム | ストラスコナ薬局 | |
| イソフルレン | WDDC | 100339 |
| Hemostam | WDDC | 103857 |
| フルニキシン | WDDC | sch140100 |
| エンロフロキサシン | WDDC | hll0049 |
| メトロニダゾール | WDDC | 101653 |
| アンピシリン | WDDC | NOV67185 - 6 |
| セファゾリン | WDDC | nov69397 |
| 手術用機器および消耗品 | ||
| Electroscapel | Macan | MV8 |
| 暖房マット | ケイン | PHMD - 48 |
| 胃管（Nalgeneチューブ5 / 16"ID） | フィッシャーサイエンティフィック | |
| ニードルドライバ | WDDC | 108338 |
| アディソン茶色forcep | WDDC | 911075 |
| ラット歯forcep | CDMV | 5275 |
| ケリーforcep | WDDC | 901133 |
| モスキート止血鉗子 | WDDC | 108471 |
| Carmalt forcep | WDDC | 901225 |
| スカルペルハンドル | WDDC | 900285 |
| 手術用メスの刃＃22 | WDDC | 900511 |
| Metzenbaumのはさみ | WDDC | 901166 |
| シャープ、鋭いはさみ | WDDC | 108264 |
| 布鉗子 | WDDC | 901213 |
| アリス組織forcep | WDDC | 901201 |
| ドアイヤンのforcep | WDDC | 904226 |
| ステンレス製ボウル | WDDC | 903601 |
| ステンレス鋼トロカール（湾曲） | ローカルサプライヤー | |
| カテーテルイントロデューサー | WDDC | 11440 |
| 外科用タオル | CDMV | 7972 |
| 使い捨てドレープ | WDDC | 900035 |
| Steriドレープ | CDMV | 2323 |
| ドレープ（40 × 40センチ） | CDMV | 8358 |
| 外科用ドレープ（7"× 11"オープニング） | CDMV | 2694 |
| Vicryl（2-0） | WDDC | JJMJ333H |
| シルク2から0 | WDDC | 105248 |
| 腸線＃3 | WDDC | CSL547 - 2070 |
| Supramid第1位 | WDDC | CSL547 - 3040 |
| 針（切削および非切削） | WDDC | |
| カテーテル | ||
| シラスティックチューブ（0.040"ID、0.085"OD） | フィッシャーサイエンティフィック | 11から189 - 15D |
| Orbeseal軟膏 | WDDC | 106344 |
| 透明なシリコーン（732多目的シール剤） | ローカルサプライヤー | |
| 平滑末端の針 | WDDC | 905035 |
| マーカー（永久的な産業） | ローカルサプライヤー | |
| カテーテルのポーチ（エラストプラスト7.5cmの構築） | WDDC | 104094 |
| 包帯 | ||
| 病院のテープ（2"） | WDDC | 103842 |
| 病院のテープ（1"） | WDDC | VLMRENF20 |
| ガーゼスポンジ4x4の | WDDC | 107551 |
| ガーゼがくっつく | WDDC | 107633 |
| エラストプラスト7.5センチメートル | WDDC | 104094 |
| エラストプラストrippable包帯 | WDDC | 104093 |
| NEedlesとシリンジ | ||
| シリンジ（60 ml）を | WDDC | 104004 |
| シリンジ（10ml）を | WDDC | bdc301604 |
| 25Gのニードル | WDDC | BDC305122 |
| 20Gのニードル | WDDC | BDC305175 |
| 18Gのニードル | WDDC | 903353 |
| 静脈内 | ||
| Intracath静脈カテーテル（16G 8"） | WDDC | bdc3831621 |
| 静脈内投与セット（10滴） | WDDC | 101797 |
| 0.9％NaCl溶液 | WDDC | BAXJB1322P |
| Plasmalyte 148ソリューション | WDDC | BAXJB2534 |
| デキストロース | WDDC | MCT60190 |
| 蠕動ポンプ | コールパーマー | 7524〜10 |
| 家畜の識別タグのセメント | ローカルサプライヤー | |
| Sanatizers /消毒剤 | ||
| Germexソリューション | WDDC | mtc60270 |
| イソプロピルアルコール | WDDC | 104590 |
| Stanhexidineクレンザー | WDDC | 109248 |
| Prepodyneソリューション | WDDC | 105710 |
| Prepodyneスクラブ | WDDC | 105711 |
欧米の医薬品物流センター（株）、エドモントン、AB。
B獣医薬物流センター（株）、サンティアサント、QE。
参考文献
- Vidal, J. E., McClane, B. A., Saputo, J., Parker, J., Uzal, F. A. Effects of Clostridium perfringens beta-toxin on the rabbit small intestine and colon. Infect. Immun. 76, 4396-4404 (2008).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet. Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Uzzau, S., Leori, G. S., Petruzzi, V., Watson, P. R., Schianchi, G., Bacciu, D., Mazzarello, V., Wallis, T. S., Rubino, S. Salmonella enterica serovar-host specificity does not correlate with the magnitude of intestinal invasion in sheep. Infect. Immun. 69, 3092-3099 (2001).
- Gerdts, V., Uwiera, R. R. E., Mutwiri, G. K., Wilson, D. J., Bowersock, T., Kindane, A., Babiuk, L. A., Griebel, P. J. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J. Immunol. Methods. 256, 19-33 (2001).
- Greibel, P. J., Davis, W. C., Reynolds, J. D. An analysis of the growth and differentiation of b cells isolated from follicles from ileal Peyer's patch of sheep. Immunology. 75, 601-607 (1992).
- Motyka, G., Greibel, P. J., Reynolds, J. D. Agents that activate protein kinase C resue sheep ileal Peyer's patch B cells from apoptosis. Eur. J. Immunol. 23, 1314-1321 (1993).
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再版と許可
