個別散在セルの優位を持つ細胞診標本からのセルブロックの準備

はじめに：

これはHistoGelTM（サーモサイエンティフィック）（HG）を使用して液体ベースの細胞診（LBC）標本からのセルブロックの準備のためのShidhamの方法を説明するビデオです。他のランダムなアプローチと比較して、以下は単独で散在バラセル（1-5）と比較的hypocellular標本から細胞のブロックを製造するためのこのプロトコルの2つの重要な機能です。

1. このプロトコルは、セルのブロックの切断面に平行な平面に沿って細胞を濃縮するための手順が含まれます。
2. また、以下の目的のうちの2つを提供するAV -マーカー（図1b）、のビーコンのようなダークインクルージョンが含まれています。
   1. 細胞が濃縮されるレベルを可視化へ。暗い色のビーコンが切削中にさらされているときに目的の細胞と細胞のブロックの面積は現在histotechnologistによって可視化することができます。監視するには、この能力は、細胞の大部分でレベルを切断、またはサンプルの細胞の最も高い濃度でのレベルにあまりにも表面的なカットではないのを妨げる。
   2. 別のスライド上でシリアルセルブロックのセクションのロケータの基準点として機能する。この基準点は、SCIPのアプローチ（6,7）と座標の免疫反応性のパターンの評価のための細胞の特定の細胞またはグループを検索するためのビーコンとして機能します。

PROTOCOL（図2）

サンプルの調製。

1. 平底ガラス管（直径15mmさx 45mm）（2.4〜図2.1）に残留LBC子宮頸部細胞診標本を転送する。大きなプラスチック製のキャリアのチューブ（28 × 85ミリメートル）と遠心分離機にガラス管を置きます。キャリアのチューブからガラス底のチューブを外し、上清を取り除き。
2. ガラス管は、蓋を（次のステップで加熱水の流出を防止するため）と大きな平底のキャリアのプラスチックチューブの内側に戻される
3. ガラス管を含むキャリアのプラスチック製のチューブは、その後、ふたを遠心分離機に入れ（ 細胞がガラス管の平らな底に垂直に落ちるように旋回カップではなく、固定アングルカップ付き ）、および1805でG（3000 rpmをスピンしているローター半径- 17センチメートル）5分（図2.5）のため。
4. 試験管を遠心分離器から垂直に削除され、小さなガラス管は、細胞を沈殿ペレットを乱すことなく、より大きなキャリアのプラスチックチューブから鉗子で除去する。
5. 試験片とガラス管が非キャップされ、上清は下部の堆積物の細胞の平らな層（図2.6）を乱さないように注意しながらオフ注がれています。

基準座標AV -マーカーの包含およびゲルの追加

1. 暗いビーコンAV -マーカー （2 × 2mmの大きさについて、フラットは、暗い色、sectionable材料の断片を表面化）（図3）ガラス管（図2.7）への道標として追加されます。
2. ミディアムパワーで10秒間電子レンジで溶かしてHGのアリコートを液化する。
3. 、チューブに溶融HGの0.5 mlを加え素早く堆積物と混合し、（図2.8）、それを要約（HGが凝固を開始できるようにすることなく、迅速に次のステップに進みます）。
4. キャリアのプラスチックチューブに温かい（45℃）水（図2.9）の約2.5 mlを追加します。
5. 小さなキャップガラス管は、暖かい水とプラスチック製のチューブ内に配置されます。 （この手順は、次のステップの間に固化するからHGを維持する必要がある）（図2.9）。
6. キャリアのプラスチック製のチューブは、（ 細胞がガラス管の平らな底に垂直に落ちるように旋回カップと固定されていない角のカップ付き ）遠心分離機に入れ、と5のための1805 G（3000 rpmの、ローター半径- 17センチメートル）で回転さ分。この遠心分離のステップの目的は、AV -マーカーをプッシュすると近い最後のパラフィン包埋細胞のブロック（図1d）の切断面の層に細胞を集中することです。
7. チューブを下部に、サンプルの細胞と沈殿した薄い層を乱さないように注意しながら遠心機から静かにして垂直に削除されます。
8. 大きなプラスチック製のチューブは非キャップされており、小さいガラス管は、試料の細胞の堆積層を乱すことなく、ピンセットで垂直に削除されます。
9. 小さなガラス管は、HG（図2.11）を冷却固化するために15分間垂直位置で冷凍です。

最終処理のための試料を用いてゲルのボタンなど、セルブロックの除去

1. 下部に集中/堆積物試料の層を持つ固化HGディスクは、注射器（図2.12）と23ゲージの針を通して10％ホルマリンを潮吹きで平坦な底部のガラス管から外れている。
2. 針は、試料（図2.12）と固化HGディスクの周辺部での管の側面に沿って挿入されます。
3. needlホルマリンがゆっくりとシリンジを介してプッシュされる一方、電子は管の側面に沿って回転される。暗い色のビーコンAV -マーカーとガラス管の平底（図2.12）からそれに集中標本とともにHGボタンの分離でこの結果。
4. セルブロック（試料の細胞とゲルのボタン）は、標識カセット内に配置し、パラフィン包埋セルブロック（図2.13）を調製するために組織の処理のために送信されます。

埋め込みと試料の切断

1. ディスクは切断面のようなダウン暗いビーコンマーカー側（図1）とパラフィンに埋め込まれています。
2. ビーコンなどの暗い色のAV -マーカーが露出し、はっきりと見えるようになるまでブロックは切片です。
3. 3〜4ミクロンの切片を試料から単独で散在する細胞のほとんどが含まれている必要がありますこのレベルからカットされています。
4. セクションは、さらに染色、免疫組織化学染色、または示されるように他のテスト用のガラススライド上に収集されます。セクションをマウントするために使用するスライドの種類を含めこれらのテストのためのプロトコルが異なる場合があります。一般的に免疫染色のために、コーティングされたスライドは、免疫染色のステップ中に浮遊し、スライドからセクションの損失を防ぐために使用されます。

（アルファベット順）使用される略語：CISH、in situハイブリダイゼーション試験発色、FISH、蛍光in situハイブリダイゼーション試験、FFPE、ホルマリン固定パラフィン包埋、FNA、穿刺吸引、HG、HistoGel™（サーモサイエンティフィック）; LBC、液体ベースの細胞診、PCRのポリメラーゼ連鎖反応;

図1。Shidhamのプロトコルによって調製された細胞のブロックの構造。

図2。ShidhamのプロトコルによってLBC検体からのセルブロックを調製するためのさまざまな手順の概要。

図3。バナナの皮からAV -マーカーの調製。

図4とし、AV -マーカーなしのセルブロックとセクションの比較。

図5。AV -マーカーがある場合とない場合のセルのブロックのセクションの細胞数の比較。

Cell blocks are a valuable tool for evaluation of various cytology specimens (1). Most importantly, in addition to the architectural details of the specimen, cell blocks allow for evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, fluorescent/chromogenic in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ PCR. A variety of methods for preparation of cell block are described. However, most of these are suitable for non-gynecologic cytology specimens which contain relatively many cells and with tissue microfragments such as in FNA aspirates and some serous fluids such as effusions (1,3,4,5).

Because cell blocks primarily provide the opportunity for immunocytochemical evaluation, their processing should preferably be similar to that of the formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Ultimately the results obtained after immunocytochemical evaluation of cell block sections are compared to those with the published literature performed predominantly on FFPE tissue sections. Any alterations in the protocol potentially compromise and nullify the validity of the results obtained on cell blocks processed through different fixatives and reagent sequences other than that used for routine FFPE. Some commercial techniques may have the drawback of processing through a protocol of exposure to other fixative-reagent exposure.

Various methods of cell block preparation are available for specimens with a significant quantity of sediment and tissue fragments. Principally, the concentrated sediments are supported by some gel or coagulation principle. The maneuverable button is then embedded in paraffin after processing like the surgical pathology specimens/biopsies.

The gels used include gelatin, agar, fibrinogen/plasma-thrombin, and other commercial gels such as HG. The methods of concentration vary from simple pelleting of the sediment by centrifugation to concentration of cells along various types of membranes. Examples include: Milipore, collodin (Celloidin) bags or scraping the cells from the cytology smears on glass slides (1). We also evaluated a variety of gels by trying different combinations of agar and gelatin. None of the combinations achieved the a firm enough consistency to obtain an easily maneuverable disc of solidified gel with embedded cells from the specimen in one piece. HG showed appropriate consistency and in our experience the immunostaining results on HG cell block sections have been excellent.

Liquid based cytology (LBC) specimens for cervicovaginal cytology are generally less cellular than non-gynecologic specimens as mentioned above. In addition, the gynecologic LBC specimens predominantly contain individual scattered exfoliated superficial cells from cervicovaginal mucosa. Due to this, appropriate cellularity within the cell block sections may not be achieved without a special approach. As these singly scattered cellular components in the the block cannot be seen by the histotechnologist during section cutting, the level at which the cells start appearing in the sections cannot be appreciated and may be missed, either by cutting past the level with most cells or not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells (Figure 4). Shidham’s protocol addresses both of these issues using HG as embedding medium and conventional lab equipments (2) (Figure 2).

This protocol involves following two major features (Figure 1):

1. Concentration and alignment of singly scattered cells in a narrow plane adjacent and parallel to the cutting surface of the cell block (Figure 5).
2. Inclusion of a beacon-like dark AV-marker as a signpost. This is critical for achieving following features:
   1. Identifying and monitoring the level at which the cells are concentrated in the cell block. The exposure of the dark colored signpost highlights the level at which most of the singly scattered cells in the cell block are expected to be located (Figure 4). This prevents the overcutting (cutting past the level with most cells) or undercutting (not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells) in to the cell block and allow selection of the sections from the level in the cell block corresponding with highest concentration of cells.
   2. The dark colored signpost in the sections also serves as a reference point to survey and identify exactly the same cells in different serial sections of the cell block on different slides (Figure 4). This is critical while interpreting and evaluating the coordinate properties such immunoprofile of particular cells by the SCIP approach to follow the same cells in different sections (6,7).

Although our protocol is standardized and reported for liquid based cervical cytology specimens, it can also be used to enhance diagnostic yield of many other non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc. In addition the AV marker would facilitate improved application of SCIP approach during immunohistochemical evaluation of cell block sections of these specimens. The embedding medium may be replaced by other reagents with appropriate modifications at relevant steps. HG may be replaced by plasma (Fibrinogen) to be gelled by Thrombin at room temperature (1).