季節低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体から分離された環境ゲノムDNAとのフォスミドライブラリーの構築が記載されている。得られたクローンのライブラリーは384ウェルプレートに取り、自動コロニーピッキングシステムのアプリケーションによって下流の塩基配列決定と機能的スクリーニングのためにアーカイブされます。
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この記事について
サマリー
要約
自然界における微生物の大半は現在、従来の栽培方法にアクセスできないままです。過去10年間、カルチャに依存しない環境ゲノム（
プロトコル
フォスミドライブラリー構築は、4つの主要なステップと（概要については、図1を参照）いくつかの部分に分け、サブに分かれています。
ステップI（[3]"0.22μmのSterivexフィルタからのDNA抽出"プロトコルを参照してください）
パート1：酵素触媒による細胞溶解
パート2：CsCl密度勾配遠心分離とDNAの回収による環境DNAの精製
パート3：ゲル電気泳動により抽出されたDNAの品質管理
ステップII
パート1：回収された環境DNAの酵素的修飾の手順
環境DNAの末端の修復ステップに必要なすべての試薬はEPICENTREからPCC1フォスミドライブラリーの製造キットに含まれています。理想的には、ゲノムDNAの0.5μg/μlに調整する必要があります。
- 氷の上にすべての試薬を解凍、以下を組み合わせて、簡単に底にすべての液体を得るためにチューブを遠心。
- Xμlの滅菌水
- 8μlの10Xエンド修理バッファ
- 8μlの2.5 mMのdNTPミックス
- 8μlの10....
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ディスカッション
手順は、最も効率的に沿岸水のサンプルに由来するゲノムDNAを持つ大規模挿入フォスミドライブラリを生成する方法を説明しています。アップストリームゲノムDNAの抽出は、別々のプロトコル[3]に記述されています。
フォスミドライブラリとしての生産は、すべての4つ表示される手順を含む、全体の手続きに間に合うように多段階のプロセス、計画は少なくとも2〜3週間です。ゲノムDNAの抽出は、最も重要なステップであると、すべてのダウンストリームの手順は、抽出されたゲノムDNAの質と量に依存しています。ため、このステップのために十分な時間を費やして検討し、慎重に作業。あなたの抽出されたDNAの質と量の制御は非常に重要です。これはあなたが作るしようとしている最初のライブラリの場合は特にそれは、フォスミドクローンの数が少ないことが起こり得ます。自体はフォスミドライブラリーの構築がまっすぐなので、故障は、主に不十分な品質及び/またはあなたの抽出精製したゲノムDNAの量によって引き起こされます。ゲノムDNAを再抽出し、図書館の建設が成功しなかった場合、精製およびDNA -回復に関連するステップに特別な注意を払.......
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開示事項
私は、開示に何もない。
謝辞
我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTとSLは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからの奨学金によってサポートされていました。 MTはまた、ドイツ学術振興協会（DFG）から奨学金の支援を受けた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ステップ II | |||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | フォスミドライブラリー 9-10 個分を構築するのに十分な量 |
| SeaPlaque アガロース | Cambrex | 50100 | |
| 撹拌機能付きホットプレート | Corning | PC-420D | |
| 1.0X TAE 泳動バッファー | |||
| CHEF Mapper XA パルスフィールド電気泳動システム（冷却モジュールおよび可変速ポンプを含む） | Bio-Rad | ||
| λ DNA-HindIII 消化済みDNA | New England Biolabs | N3012S | |
| MidRange I PFG マーカー | New England Biolabs | N3551S | |
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | |
| 電子レンジ対応プラスチックラップ | Saran premium wrap | ||
| Safe Imager トランスイルミネーター | Invitrogen | S37102 | |
| GELase アガロースゲル消化用調製試薬 | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| メス | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit（Ultracel-10 メンブレン付き） | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | |
| ヌクレアーゼフリー水 | Ambion | AM9932 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 回分*# | Invitrogen | P7589 | |
| デジタルドライブロックヒーター | VWR international | 12621-088 | |
| ウォーターバス | VWR international | 14231-854 | |
| 遠心機 | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| 遠心機ローター | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| 卓上遠心機 | Eppendorf | 5415D | |
| マイクロ遠心チューブ, 1.7 mL, 透明 | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| 15 mL 遠心チューブ | Fisher Scientific | 430052 | |
| ステップ III | |||
| LB 液体培地 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| ファージ希釈バッファー | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | ||
| クライオバイアル | Fisher Scientific | 430488 | |
| ステップ IV | |||
| 96ウェルプレート（蓋付き） | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| 384ウェルプレート（蓋付き） | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| シャーレ 100 O.D. x 15mm H | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| シャーレ 150 Dia. x 15mm H | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| クロラムフェニコール | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| LB 液体培地 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Difco アガロース | BD Biosciences | 214530 | |
| ガラスビーズ | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| 漂白剤 | Javex | ||
| エタノール | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 15 mL 遠心チューブ | Fisher Scientific | 430052 | |
| QPix コロニーピッカー | Genetix | QPix2 | |
| ピッキングヘッド (E. coli) | Genetix | X4006 |
参考文献
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.
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再版と許可
