Method Article

大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

季節低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体から分離された環境ゲノムDNAとのフォスミドライブラリーの構築が記載されている。得られたクローンのライブラリーは384ウェルプレートに取り、自動コロニーピッキングシステムのアプリケーションによって下流の塩基配列決定と機能的スクリーニングのためにアーカイブされます。

Abstract

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自然界における微生物の大半は現在、従来の栽培方法にアクセスできないままです。過去10年間、カルチャに依存しない環境ゲノム（

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フォスミドライブラリー構築は、4つの主要なステップと（概要については、図1を参照）いくつかの部分に分け、サブに分かれています。

ステップI（[3]"0.22μmのSterivexフィルタからのDNA抽出"プロトコルを参照してください）

パート1：酵素触媒による細胞溶解

パート2：CsCl密度勾配遠心分離とDNAの回収による環境DNAの精製

パート3：ゲル電気泳動により抽出されたDNAの品質管理

ステップII

パート1：回収された環境DNAの酵素的修飾の手順

環境DNAの末端の修復ステップに必要なすべての試薬はEPICENTREからPCC1フォスミドライブラリーの製造キットに含まれています。理想的には、ゲノムDNAの0.5μg/μlに調整する必要があります。

  1. 氷の上にすべての試薬を解凍、以下を組み合わせて、簡単に底にすべての液体を得るためにチューブを遠心。
    • Xμlの滅菌水
    • 8μlの10Xエンド修理バッファ
    • 8μlの2.5 mMのdNTPミックス
    • 8μlの10....

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Discussion

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手順は、最も効率的に沿岸水のサンプルに由来するゲノムDNAを持つ大規模挿入フォスミドライブラリを生成する方法を説明しています。アップストリームゲノムDNAの抽出は、別々のプロトコル[3]に記述されています。

フォスミドライブラリとしての生産は、すべての4つ表示される手順を含む、全体の手続きに間に合うように多段階のプロセス、計画は少なくとも2〜3週間です。ゲノムDNAの抽出は、最も重要なステップであると、すべてのダウンストリームの手順は、抽出されたゲノムDNAの質と量に依存しています。ため、このステップのために十分な時間を費やして検討し、慎重に作業。あなたの抽出されたDNAの質と量の制御は非常に重要です。これはあなたが作るしようとしている最初のライブラリの場合は特にそれは、フォスミドクローンの数が少ないことが起こり得ます。自体はフォスミドライブラリーの構築がまっすぐなので、故障は、主に不十分な品質及び/またはあなたの抽出精製したゲノムDNAの量によって引き起こされます。ゲノムDNAを再抽出し、図書館の建設が成功しなかった場合、精製およびDNA -回復に関連するステップに特別な注意を払.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
私は、開示に何もない。

Acknowledgements

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我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTとSLは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからの奨学金によってサポートされていました。 MTはまた、ドイツ学術振興協会（DFG）から奨学金の支援を受けた。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Step II
CopyControl™Fosmidライブラリ生産キットEpicentre Biotechnologies CCFOS110、9-10 fosmidライブラリを生成するのに十分
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
攪拌ホットプレートCorningPC-420D
1.0X TAE ランニングバッファー
CHEF Mapper XA 冷却モジュールと可変速ポンプを含むパルスフィールド電気泳動システムバイオ・ラッド
λDNA-HindIII DigestNew England BiolabsN3012S
MidRange I PFG MarkerNew England BiolabsN3551S
10,000X SYBR GoldInvitrogenS11494
microwavable plastic wrapSaran premium wrap
Safe Imager transilluminatorInvitrogenS37102
GELase Agarose Gel-Digesting準備Epicentre BiotechnologiesG09100
メスフィッシャーサイエンティフィック08-927-5D
アミコンウルトラ-4遠心フィルターユニット、ウルトラセル-10メンブレン付きEMDミリポアUFC801024
マイクロコンYM-30遠心フィルターユニット EMDミリポア42410
ヌクレアーゼフリーウォーターアンビオンAM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*#InvitrogenP7589
デジタル ドライブ ブロック ヒーターVWR 国際12621-088
ウォーターバスVWR 国際14231-854
遠心分離機Beckman Coulter Inc.Avanti J-E
遠心分離機ローターベックマン・コールター社JA 5.3
卓上遠心分離機Eppendorf5415D
微量遠心チューブ、1.7 mL、透明Axygen ScientificMCT-175-C
15 mL 遠心分離チューブ フィッシャーサイエンティフィック430052
<ストロング>ステップIII
LBブロスフィッシャーサイエンティフィックBP 1426-2
MgSO4Sigma-AldrichM2643
ファージ希釈バッファー10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
>cryogenic vialsFisher Scientific430488
Step IV
96 well plate with lidFisher ScientificCS003370(3370)
384 蓋付きウェルプレートフィッシャー・サイエンティフィック07201157(3680)
ペトリ皿 100 O.D. x 15mm Hフィッシャー・サイエンティフィック08-757-12
ペトリ皿 150 Dia. x 15mmHフィッシャー・サイエンティフィック08-757-14
BD ファルコン バイオディッシュ XL 245 X 245 mmVWR 国際CABD351040
グリセロールSigma-AldrichG5516
クロラムフェニコールSigma-AldrichC0378
LB ブロスフィッシャーサイエンティフィックBP 1426-2
ディフコ寒天BD バイオサイエンス214530
ガラスビーズフィッシャーサイエンティフィック10-310-1
QFill3ジェネティックスX3050
漂白剤ジャベックス
エタノールSigma-AldrichE7023
15 mL 遠心分離管フィッシャー サイエンティフィック430052
QPix コロニーピッカージェネティックス QPix2
ピッキングヘッド (大腸菌) ジェネティックスX4006
です

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

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