これは、すぐに紫外線で不活化精子と受精した後、第二減数分裂をブロックすることにより、雌性発生二倍体のゼブラフィッシュの胚（遺伝のみ寄与母親由来胚）を生成するための方法です。 EPの胚は、最初の減数分裂時の組換えが原因で完全にホモ接合体ではない、しかし、彼らは再結合することにより、動原体から分離されていないすべての遺伝子座でホモ接合である。
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この記事について
サマリー
要約
二倍体真核生物におけるヘテロ接合性は、しばしば遺伝学的研究が面倒になります。ヘテロ接合の雌から直接実行可能なホモ接合二倍体の子孫を生成するメソッドは、F1変異女性が加速フォワード遺伝学的スクリーニングに有害な突然変異を直接スクリーニングすることができます。 Streisingerら。
プロトコル
初期の圧力の概要
注：このようなtricaine、魚の水とハンクス生理食塩水、このプロトコルで使用される試薬の多くのためのレシピは、ゼブラフィッシュブック3（第10章をオンラインで利用することができますhttp://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html ）
- UV不活化精子を用いた体外受精で胚を作り出す。
- すぐに卵を水でいっぱいに充填されたガラスバイアル（プラスチック製のスナップキャップ付き）に受精卵を転送する。ラテックスゴムの薄いシートでバイアルの開口端部を覆い、ゴム製オーバーバイアルにトップを（穴が切断されているに）スナップ。
- 油圧プレスでバイアルを置き、1.4分で受精した後、8000 psiの（多くのプレス機を2インチ径のピストンにかかる圧力を読み取るために較正されている、との読みがPSIに変換する必要があることに注意）に圧力を上げる
- 受精後6分で始まる、徐々に1分間の期間にわたって圧力を解放。
詳細な初期圧力の手順
- 実験の前日
- ....
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ディスカッション
この方法により製造された胚は、真の雌性発生二倍体であることを確認することが重要です。コントロールとして、通常の二倍体の卵（UV不活化せずに精子のいくつかを取っておくことにより）と一倍体の胚（EPの手順を経由せずにUV精子で受精卵のクラッチを脇に保つことによって）のクラッチのクラッチを生成する。 1日の後の受精の一倍体胚ではショートボディの軸、不規則な脳と体節の形態を持っている。半数は2〜3日後に実行可能ではありません。いくつかの不規則な"EPのモンスターが"発生する可能性があるものの、EPの二倍体は、通常の二倍体のようになります。 EPの二倍体のクラッチは、（70〜90％）、主に実行可能でなければなりません。 EPの二倍体のクラッチの半数体の存在は、EPのプロセス（例えば、圧力を保持するために失敗を押して）で障害が発生したことを示唆している。半数体クラッチの二倍体の存在は、不完全な精子の不活性化を（例えば架橋剤の失敗）を示唆している。
EPの二倍体が前方に遺伝画面4,6で識別されるマップの突然変異体に遺伝子セントロメア距離1を<.......
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謝辞
体外受精と雌性発生二倍体のための方法は1970年代と1980年代にオレゴン大学のジョージStreisingerの研究室でシャーリーンウォーカーによるゼブラフィッシュのために開発されました。方法は、ここで説明ゼブラブック3で完全に利用可能であるシャーリーンのプロトコルから変更されていません。
体外受精と雌性発生二倍体のための方法は1970年代と1980年代にオレゴン大学のジョージStreisingerの研究室でシャーリーンウォーカーによるゼブラフィッシュのために開発されました。方法は、ここで説明ゼブラブック3で完全に利用可能であるシャーリーンのプロトコルから変更されていません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| トリカイン | Sigma-Aldrich | ||
| 時計皿 | |||
| フレンチプレス | |||
| 圧力シリンダー | |||
| インスタントオーシャン | |||
| パステールピペット | 細い端を切り落とし、火炎磨きを行う | ||
| UVクロスリンカー | |||
| マイクロキャピラリー |
参考文献
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Weste....
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