単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Summary

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。

Abstract

生きた細胞のメカニズムへの完全な洞察は、細胞レベルでの事象を惹起し、ダイレクトキープロセスを調べることによってのみ達成することができます。生物系のせん断複雑さをこれまでには、代わりに相対的に原油バルクアンサンブル平均測定を使用して単一システムの研究に焦点を当て、あまりにも要求される正確な単一分子実験を引き起こしている。しかし、多くの重要なプロセスは一つのレベルで生きている細胞や少数の分子で起こる、アンサンブルの測定値は、一般的にこれらのイベントの確率と異種の性質を覆い隠す。ここでは、高度な光学顕微鏡と我々は、単一の分子とどのように我々は生物学的機械の機能に分子複合体内動態を観察できるの精度への単一の生きた細菌細胞内のタンパク質を監視する方法を示す分析画像解析ツールを使用して。テクニックは、生理学的に直接関連しています。彼らが検討されて生体試料に最小限の摂動と非侵襲的であり、完全に生体を構成する物質の調査、生物物理学の他の単一分子のアプローチが容易に利用できない機能に同調されています。さらに、生物学的標本は、すべて自然に発生するよりもはるかに多くのタンパク質を生成するための、より一般的ですが、理想的なアプローチとは対照的に変更されていない細胞株（"ゲノムエンコード"）とほとんど同一のレベルで、少なくとも蛍光タグタンパク質を生成する研究（"発現プラスミド"）。このように、調査される実際の生物学的サンプルは、自然の生物にかなり近いですので、実際の生理学的プロセスへの観察は、より関連性の高い。

Protocol

1. この手順を開始するには、 大腸菌の細菌細胞を発現する蛍光蛋白質の凍結ストックの50μlを最初に解凍し、午前中は37℃で一晩5 mlのLB培養培地で振盪しながら好気的に栽培されている、この飽和文化の50μlを抽出し、 、最小のM63グルコースの培地へと継代培養4〜6時間、30℃でインキュベートする。ここでは、電子輸送を表現するそのうちの一つ、2つの異なる細胞株を、使用例を示すGFP、GFPと融合した細菌べん毛モーターに関与するタンパク質を発現する他に融合されたチトクローム。
2. 細胞は固定化のサンプルとしてそれらを表示する場合のいずれかに成長のサブカルチャーから直接採取したり、それらは"テザー"の条件で表示する場合細菌の鞭毛を切り詰めるために剪断することができます。
3. せん断は、無菌配管で結合された2つの滅菌注射器で構成されるデバイスに典型的にはサブカルチャーの1〜5ミリリットルを置くことが含まれます。せん断は、狭いチューブを通して文化をプッシュするごとにシリンジポンプを押し込んで交互に行われます。これは、必要なせん断の程度に応じ、50〜100倍が行われる。文化は、鞭毛のフラグメントを削除するには、最少培地で再懸濁している細胞をペレットに遠心分離されています。
4. 私たちは、その後、その後、脱イオン水とエタノールで徹底的に洗浄し、少なくとも1時間空気中で乾燥するまま、20分間エタノールにKOHの飽和溶液に浸漬することにより、BK7ガラス製カバースリップの洗浄準備
5. 我々は、顕微鏡で細胞を収....

Discussion

これは、べん毛モーターの機能を損なうおそれがあるので注意が、つながれた細菌を調べるための細胞"せん断を介して"しないように注意する必要があります。彼らは酸素枯渇になる可能性があるので、顕微鏡スライド上に、1時間に1回よりもはるかに長いためにセルを使用することが重要です。かなりの最適化は、最適な顕微鏡の撮像条件が検討され、特定の生物学的システムへの仕出し料理見つけるために必要となる場合があります。それはあなたの特定の顕微鏡システムに必要な正しい強度レーザーの励起を確認するために単独で精製GFPを用いたイメージングを試みることが賢明かもしれない。

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