染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

サマリー

核型分析は、広く遺伝子変異を検出するために使用されるシンプルかつ有用な技術である。ここでは、文化の中で維持、これらの細胞の染色体の状態を監視するためのヒト胚性幹細胞の染色体の広がりの準備のためのステップのプロトコルバイステップで説明します。

要約

ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）安定した二倍体の核型^1を提示することが示されているが、多くの研究は、培養条件に応じて、彼らはそのような全体または染色体の部品の追加などの染色体異常を取得する傾向になることを報告している。確かに、長期培養の間に、核型の変化はときに酵素的または化学的解離が観察される継代のためのコロニーのマニュアル解剖が安定核型^5を保持しながら^、2,3,4が使用されています。加えて、フィーダー細胞の除去など環境の変化はまた、ヒトES細胞^3,6の遺伝学的完全性が損なわれるようです。一度染色体変異が細胞生理に影響を与える可能性、in vitroでのヒトES細胞の遺伝的整合性の特性は、胚発生の研究と薬物検査に不可欠なツールとして重要な考慮hESCのです。さらに、将来の治療目的のために染色体の変化が頻繁に発癌に関連付けられているように大変な問題です。

ここでは、G -バンディング、FISH、SKYやCGHの技法^7,8で設定された染色体のその後の分析のために高品質の染色体のスプレッドを得るために簡単で便利な方法を示しています。我々は、転座とaneuploidiesの外観をモニターするために5継代の間隔で定期的に染色体の状態を確認することをお勧めします

プリシラブリットとラファエラサルトルは、紙にも同様に貢献した。

プロトコル

装置

• 組織培養インキュベーター、37℃、5％CO ₂
• 遠心
• micropipettorsのセット（100、100μL）
• 水浴37℃
• 水浴90℃の蒸気の水の源になるために
• 位相差顕微鏡

FIRST STEP

コルセミドで細胞を処理する

この手順では、20％ノックアウト血清代替（KSR、ギブコ社）と8ng/mLのを補充マイトマイシンC（シグマ）で不活化とDMEM/F12（Invitrogen）中で維持マウス胚線維芽細胞（MEF）上に培養したヒトES細胞のラインH9を使用線維芽細胞増殖因子（FGF - 2、R＆D）。

分裂中期スプレッドの多数を得るために、それを多くの分裂細胞が存在するで高い分裂インデックスを持つ文化を使用することをお勧めします。

1. インキュベーターから培養フラスコを取ると、層流で、0,1μg/ mLの最終濃度でコルセミド追加。
2. インキュベーターにフラスコを返し、阻害剤は、染色体がうまく凝縮されており、顕微鏡下で容易に可視化できる中期、上に有糸分裂停止を引き起こす可能性があるので、3時間を待つ。

細胞を固定

3. 培地を取り出し、細胞の表面をカバーするのに十分トリプシン/ EDTA、0.05％追加。細胞は室温で5分間インキュベートし、血清を含む培養培地を追加したり、単に細胞に血清添加することによりどちらかの酵素を不活性化することができます。
   注：単一の細胞懸濁液は、良好な分裂中期スプレッドを取得するために達成されていることを確認することが重要です。
4. 15 ml遠心チューブと5分は122 gで遠心して細胞を移す。
5. 約200 mLを残し、上清を捨て、そして、ビデオに示すようにチューブを、タップして穏やかにペレットを再懸濁します。細胞がよく解離されるので、ソリューション内の任意の塊を視覚化できないことを確認してください。
6. 次に、低張液5 mL（塩化カリウム75mmの）37に予め温めておいた° C、ゆっくりと、以下の説明のように管壁によって。を追加する必要があります。最初だけでその後低張液で細胞を混ぜ、残りの2 mlを加え37℃で保温℃で15分間に水平位置にチューブを反転、3 mlを加える。
   注：この時点で、低張液は細胞のボリューム上の増加を引き起こし、染色体を解くのに役立ちます。インキュベーションの時間は、良好な染色体のスプレッドを獲得することが重要です。タイミングが長すぎる場合、細胞膜には早すぎると染色体が失われて破裂することがあります。短すぎる場合、細胞膜が中断されないことがありますので、それは染色体のスプレッドを得ることが困難な場合があります。
7. 固定液（メタノール/氷酢酸3:1）の3滴を追加、休憩なしで5分間、122 グラムの細胞と遠心機で固定溶液を混合して軽くチューブを反転させる。
   注：固定溶液をたててください。
   注：材料の損失を防止する、細胞の減少を避けるために、休憩なしで遠心分離を使用することが重要です。
8. 約200 mLを残し、上清を捨て、そしてチューブの底を軽くたたくことによって静かにペレットを再懸濁します。
   注記：ここでも、細胞がよく解離されるので、ソリューション内の任意の塊を視覚化できないことを確認してください。
9. もしチューブを回転しながら、管壁が徐々に、固定液の最初の3 mLを加え。単に細胞を混合し、細胞をダウンさせるために管壁で固定溶液中より2 mLを追加するには、水平位置にチューブを反転。 4℃で一晩株式。
   注：固定された細胞は4℃ヶ月間固定液に保存することができます℃のその膨潤状態で細胞を保護する以外に、固定液は脂質と変性蛋白質を削除します。これらのイベントは、結果として、染色体は容易に拡散させる、細胞膜が壊れやすいようにと。

スライドガラスのクリーニング

あなたの染色体スプレッドを作り始める前にスライドが適切に洗浄されているかあなたには、いくつかの核とも中期を失う可能性があることを確認してください。あなたがどんなハイブリダイゼーション技術⁹試してみたい場合は、このステップでは、同様に重要です。

1. 場所は、室温で少なくとも3時間のために6M塩酸を入れたビーカーにスライドします。
2. この時間の後、10分間水道水を流してのスライドを洗う。
3. スライドを蒸留水ですすぎ、彼らは、室温で乾燥させます。
4. 今スライドを96％エタノール中に保存され、使用の直前に、糸くずを乾燥させることができる。

注：in situハイブリダイゼーション法では、スライドを96％エタノールに2日以上保存することができます。

SECOND STEP

細胞を洗浄

10. 次の日に、休憩なしで5分間、122 グラムで細胞を遠心分離。
11. D約200mlを残して上清をiscard。軽くチューブを回転させながら、チューブは、チューブの壁が徐々に、新鮮な固定液を5ml（メタノール/氷酢酸3:1）を追加するフリックでペレットを再懸濁します。この洗浄は3回の洗浄の合計を2回以上繰り返します。
    注：固定溶液をたててください。

スライドの準備

12. 最後の遠心分離工程において（図1参照）細胞ペレットを均一化しスライドに細胞の十分な密度を得るために解決策の十分な量を残す。
13. 非常に近いと表面に平行にピペットを移動することで、清潔で乾燥したスライド上に細胞懸濁液の20〜30μLを加える。固定液が蒸発するように、スライドの表面が粗くなります。
14. すぐに、細胞が爆破させるために30秒間お湯の蒸気（90 °）に、表向き、スライドを公開します。
    注：この時点では、一緒に水で拡散染色体を刺激し増加酢酸濃​​度、結果として固定溶液が蒸発するからメタノール、。
15. 濃度だけでなく、細胞の分布は（図1参照）良いかどうかだけをチェックする位相差顕微鏡で見てください。
16. 現在のスライドは、G -バンディング（ギムザ）、FISH、SKYやCGHなどの細胞遺伝学的アプローチによる染色体のセットをチェックするために使用する準備が整いました。

重要なヒント

分析するに十分な中期の方法を選択

ラウンドと分離された分裂中期（図2D）を選択するには、2つまたはそれ以上の広がり紛れ込まない起動染色体によって生成された染色体の消失によって生成された染色体のゲインとして偽aneuploidiesを考慮して回避することができます。ので、いくつかの染色体は、それら（図2Aおよび2B）により隠れている可能性がありますので、原子核の近くに分裂中期の選択を避ける。ほかに、ラウンド分裂中期を探して、任意の染色体が分裂中期（図2C）から分離されていることを確認してください。

フィーダー細胞とヒトES細胞の核型

G -バンディングとSKYの分析のために、ヒトES細胞培養におけるフィーダー細胞の存在は、フィーダー細胞が分裂状態下にないため、結果を妨げることはありません（マイトマイシンCまたは照射によって不活性化）と中期の人口の一部にはなりません。しかし、間期核のFISH法の応用のために、それはFISH解析のために、トリプシン処理する前に手動でコロニーを収穫によってフィーダー細胞からヒトES細胞の集団を分離することが好ましい。

図1：どのようにスライドの適切な細胞密度を知っている。 10倍の目標の位相差顕微鏡の画像。 （A）細胞密度が高すぎる。矢印は核の近すぎる広がる中期を指している。 （B）良好な細胞密度とスライド。円は、核または他の分裂中期から分離分裂中期スプレッドを示しています。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

図2：どのように分析するに十分な中期を選択する。染色体はDAPIと100xの目的での蛍光顕微鏡によって得られた画像で染色されています。 （A）（B）核の近くに分裂中期（矢印で示される）（C）を避け、現在の染色体は、（丸）で区切られたことが丸くなっていない分裂中期。 （D）ラウンド中期分析する良い中期です。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。

ディスカッション

染色体スプレッドの準備は、G -バンディング、およびそのようなFISH、SKYやCGHなどのより高度なテクニックとして日常的に技術による胚性幹細胞の遺伝的状態を正常に解析するための重要なステップです。

この手順は、細胞周期の長さに依存するコルセミドインキュベーション、期間を変化させることで、多くの細胞型に適用することができます。胚様体（EB）のためにこの時間は6時間までとなることができますが、胚性幹細胞のコロニーのために、我々は3時間を待つ。

細胞凝集体での作業の場合（胚様体のような）では、単一の細胞溶液を得るために非常によく解離する必要があります。このケースでは、トリプシンおよび機械的解離した後は、プロシージャ（手続きのトピックのステップ4から）へのシーケンスを与えるして40μmのナイロンのセルストレーナー（BD Biosciences社）を利用してできます。

手順ここでは、細胞懸濁液は、成果物の過度の染色体の広がり、その結果、世代を避けるために、スライド上に"...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 ml遠心チューブ	Techno Plastic Products	91015
Colcemid Karyo MAX	GIBCO, by Life Technologies	15212-012
EDTA	Isofar	721
氷酢酸	Isofar	100
メタノール	Isofar	208
塩化カリウム (KCl)	Merck & Co., Inc.	104.931.000
スライドグラス	Bioslide	7105-1
トリプシン	Sigma-Aldrich	T4799