このプロトコルは、間葉系幹細胞および実験的移植の目的のために自己のペアを生成するために動物血清を使用することなく、内皮コロニー形成細胞の分離とその後の展開について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
へその緒は、間葉系幹細胞（とも呼ばれる間葉系幹細胞は、MSC）および内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）を含む、高い増殖能を持つ前駆細胞の豊富な情報源となります。両方の細胞型は、組織の整合性を維持するためのキープレーヤーであり、おそらくまた、再生のプロセスと腫瘍形成に関与している。
比較的にそれらの生物学と機能を研究するためには、同じドナーから入手可能な両方の細胞型を持つことが重要です。また、同じ組織からのMSCsとECFCsを導出するために再生目的のために有益であるかもしれません。
細胞治療は、最終的にベンチからベッドサイドへの道を見つける必要があるので我々は分離する新しい方法を確立し、さらに動物性タンパク質を使用せずに前駆細胞を展開します。プールされたヒト血小板溶解液（pHPLは）完全に異種蛋白質への細胞の接触を避けるために、我々のプロトコルのすべての段階においてウシ胎児血清を取り替えた。
このビデオ一臍帯からの前駆細胞の分離と拡大のための方法論を示しています。
すべての材料および手順について説明する。
プロトコル
パート1：セットアップ
1。細胞培養培地の調製
メディアの準備を開始する前に、必要なすべての材料や道具を集める。
雪解け2 ×プールしたヒト血小板溶解液の56 mlのアリコート（pHPL、自作：リファレンス1＆Joveの＃1523）、100倍ペニシリン/ストレプトマイシン液、L -グルタミンの2 × 5mLの（両方ともSigma社）を10ml。
EGM - 2培地（ロンザ）の1瓶（500 mL）を補足するために調整（、アムホテリシンは"単一のquots"として提供されているVEGF、bFGFは、EGF、IGF、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパリン）サイトカインと成長因子のアリコートを解凍。
冷蔵庫からの各（i）1つ500mlボトルを取る最小必須培地（α- MEM）および（ii）内皮基礎培地（EBM）のα-改変。
次の手順のすべては、無菌条件下で層流の組織培養フードで実行されます。
滅菌水で1000 IU / mlの最終濃度に粉末を溶解することにより防腐剤フリーヘパリン（例えば、Biochrom）準備。
MSC -....
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ディスカッション
骨髄、脂肪組織、臍帯血、等を含むMSCSまたはECFCsの取得元となる、さまざまなソースがあります
それは、直接組織と血管再生や腫瘍の進行への寄与のようなプロセスでの異なる細胞型の関与を比較するために、同じソースから前駆細胞の両方のタイプを取得する必要があります。
分離し、その後同じドナーからECFCsとMSCの自家ペアを研究する際の容易さは、個々の実験内でドナーの変化を除くためにこの方法が有利です。
造血細胞と汚染の可能性は継代の手順により最小化し、フローサイトメトリーで確認されます。
正しく行えば、分離した細胞は、（i）前駆細胞の機能を共有し、（ii）十分な量の実験的移植のために利用できるはずですし、フローサイトメトリーによって確認されたように（ⅲ）純粋である。
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開示事項
著者は宣言するために興味のある金銭的競合を持っていない。
謝辞
著者は、原稿に有益なコメント、ダニエラターレルとマルガレッタ神父hwirth技術支援のための、言語編集用のモニカファレル、ウーラング、マルギットホルツアップフェルと産科の部でサンドラEppichためpHPL、エヴァローデとニコールホフマンを提供するためのカタリーナSchallmoserに感謝コードを提供する。
この作品は、オーストリアの研究財団（FWF、DSへの助成金N211 - NAN）、オーストリアの研究推進機構（FFG、DSへの助成金N200）で、成体幹細胞研究財団（AR）によってサポートされています。 ARは、グラーツの医科大学の博士課程のプログラム分子医学の仲間です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-グルタミン | Sigma-Aldrich | ||
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| 単一サイトカインクォット | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 フラスコ | Corning | ||
| 150 cm2 プレート | Corning | ||
| セルスクレーパー | Corning | ||
| トリプシン/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| モノクローナル抗体 | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml チューブ | Falcon BD | ||
| 500 mL フィルター、孔径 20 μm | EMD Millipore | ||
| 保存剤フリーヘパリン | Biochrom AG |
参考文献
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Hu....
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