StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

Summary

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。

Abstract

2006年には、山中氏らは最初のOct4のレトロウイルス媒介送達および発現、レトロウイルスベクター、c - MycおよびKLF4はマウスの線維芽細胞の多能性状態を誘導できることを示した^。1同じグループはまた、ヒトの体細胞の正常なリプログラミングへの報告レトロウイルスベクターが提供する同じ転写因子の人間のバージョンを使用して人工多能性幹（iPS）細胞が²さらに、ジェームズトムソンらは報告している要因の別のセットのレンチウイルスを介した共発現（Oct4の、レトロウイルスベクター、NanogのとLin28 ）iPS細胞にヒトの体細胞をリプログラミングすることができた^3。

iPS細胞は、形態、増殖と身体のすべての組織型に分化する能力のES細胞に類似しています。彼らは胚の破壊の倫理的ジレンマなしでES細胞の主要な特性を示すようにヒトiPS細胞はES細胞上の明確な利点がある。患者固有のiPS細胞の生成は、非自己移植細胞の免疫拒絶反応の可能性を排除することにより、パーソナライズされた再生医療の治療に重要な障害を回避することができます。

ここではStemgentヒトTFのレンチセットを使用して、ヒト線維芽細胞を再プログラミングするためのプロトコルを示す。我々はまた、このセットで再プログラム細胞は形態四日後の伝達のiPSを表示するために始めることを示している。 Stemolecule Y27632を使用して、我々は植民地の3つの連続した​​ラウンド、ピッキングと継代後にiPS細胞と観測された正しい形態のために選択。我々はまた、多能性マーカーAP、表面マーカーTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、およびSSEA - 3、及び核のマーカーOct4の、Sox2、及びNanogのを表示する細胞をリプログラミング後のことを示しています。

Protocol

1。再プログラミング

1. 6ウェルプレートのウェル当たり1 × 10 ⁵細胞の密度でシードのBJ細胞。成長培地2mlで培養細胞を（450ミリリットルEMEM 50ミリリットルES修飾FBS、5 mlの10 mMの非必​​須アミノ酸、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5ミリリットルに200mM L -グルタミンと0.9ミリリットル55 mMのβを添加した37℃で一晩-メルカプトエタノール）℃、5％CO _2。
2. 同じ日に、6ウェルプレートに水で希釈した0.1％ゼラチンを追加し、一晩37℃、5％CO _2をインキュベートすることにより、MEFフィーダープレートの準備を開始。
3. インキュベーション後、BJ細胞から培地を除去し、ポリブレン6μg/ mlのを添加した2 mlの増殖培地を追加し、500μlのhOct4 -レンチウイルス、50μlのhSox2 -レンチウイルス、各ウェルに50μlのhNanog - レンチウイルスと50μlのhLin28 -レンチウイルス。ゆっくりと培地のさえコーティングを確保するためにプレートを揺らし。 37℃および5％CO _2を一晩インキュベートする。
4. 同じ日に、液体窒素や融解からCF - 1 MEF細胞の1バイアルを取り外します。ゼラチンコートしたウェルから液体を取り除く（ステップ1.2参照）と0.2 × 10 ⁵細胞/ウェルの密度でMEFフィーダー細胞を加える。ウェルあたりの総体積は（450ミリリットルDMEMに50ミリリットルFBS、5mlの非必須アミノ酸を補充）MEFの増殖培地中の細胞の2ミリリットルにする必要があります。
5. 翌日、5分間、200 xgで0.05％トリプシン/ EDTAと遠心機でBJ細胞を切り離します。増殖培地で培地に懸濁するを吸引除去する。 MEFフィーダープレート（ステップ1.4参照）からメディアを削除し、/ウェルBJ細胞懸濁液2 mlを加える。細胞の濃度は約5 × 10 ⁴細胞/ウェルにする必要があります。 37℃および5％CO _2を一晩インキュベートする。
6. ヒトES / iPS細胞の培養液で再播種後培地24時間を取り付けます（400ミリリットルDMEM/F12は100mlのノックアウト血清代替物は、5 mlの10 mMの非必​​須アミノ酸5 mlの200 mMのL -グルタミン、0.9ミリリットルを添加した55 mMのβ-メルカプトエタノールと20 ng / mLのヒト組み換えbFGFを）。 7日間24時間ごとに培養液を交換する。
7. 7日後に、（セクション2を参照）MEF条件培地に培地に変更。

2。 MEF条件培地の調製

1. シードCF - 1 2 × 10 ⁵細胞におけるMEFフィーダー細胞/ウェルの2ミリリットルMEFの増殖培地中で6ウェルプレートで。 37℃および5％CO _2を一晩インキュベートする。
2. ヒトES / iPS細胞の培養液に培地を変更します。 37℃および5％CO _2を一晩インキュベートする。
3. 四日間のために24時間毎に上清を集める。 0.22μmのフィルターを介して上清をフィルターします。
4. bFGFの50 ng / mlの上清を補完する。

3。 iPS細胞のコロニーの選択と継

1. Stemolecule Y27632の1​​0μMを添加したヒトES / iPS細胞培養培地中でES細胞様コロニーと再シードを選択して細胞培養皿にCF - 1 MEFフィーダー細胞を事前に播種。 37℃および5％CO _2を一晩インキュベートする。
2. 最初の7日間の24時間ごとに（Stemolecule Y27632で補足することなく）培地を変更してください。 7日後、（準備のためのセクション2を参照）MEF条件培地に培地に変更。彼らは典型的なヒトES形態を示すまで我々は、細胞を継代続いた。

4。多能性マーカーの免疫細胞化学的検討

1. 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
2. 室温で20分間、固定液500μlで細胞を固定する。
3. 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
4. 室温で1時間500μlのブロッキングバッファーで非特異的結合をブロックする。
5. 一晩4特定の一次抗体を250μlで細胞をインキュベート° C（我々は1:100でTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、SSEA - 3、Oct4の、レトロウイルスベクター、NanogのとLin28を使用希釈）。
6. 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
7. 光から遠ざけることは、室温で1時間二次抗体を250μlで細胞をインキュベートする（我々はヤギ抗マウスIgM Cy3の共役を使用、ヤギ抗マウスIgG Cy3の共役、ヤギ抗ラットIgM抗体Cy3の共役とヤギ抗1:300希釈でウサギCy3の共役）。
8. 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
9. 最後の洗浄のためにDAPIを（最終濃度1μg/ ml）を追加し、核を可視化するために5分間インキュベートする。
10. 倍率で細胞を分析する。

パート5：代表的な結果

1。形態の結果：

ヒト包皮線維芽細胞（BJ）細胞は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28 Oct4のと共同で導入した。形態学的変化は、4日後の伝達は早くも観察し、細胞のクラスターは、より緊密に17日目（図1）で満員となった。コロニーは、手動で25日目でピックアップし、CF - 1 MEFフィーダー細胞上で培養した。再プログラミング後のiPS細胞のコロニー形成を容易にするために、我々はStemolecule Y27632を用い各継代時の初期晩播のため、ROCK阻害剤、。良い形態でのiPS細胞コロニーは植民地の3つの連続した​​ラウンド、ピッキングと継代後に観察された。

2。多能性マーカーの発現：

さらに分離されたiPS細胞のコロニーを特徴付けるために、我々はES細胞に発現し、共通の多能性マーカーの存在を探した。コロニーは、強いアルカリホスファターゼ（AP）活性（図2）を示した。さらに、免疫細胞化学（ICC）は、表面マーカーTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、SSEA - 3と同様に核のマーカーを含む、多能性マーカー特異的抗体のパネルでiPS細胞のコロニーを行ったOCT4、Sox2、及びNanogの。分離されたiPS細胞のコロニーは、全てのマーカー（図3）陽性であった。 ICCの結果は、iPS細胞は、これらのiPS細胞が密接に未分化ヒトES細胞に似ていることを示している、適切な多能性マーカーの発現パターンを示したことを示している。

図1：形質BJ細胞の形態学的変化。典型的なiPS細胞で形成されたコロニー（）4日間と（B）17日後に形質導入​​の明視野像。

図2：再プログラムBJ細胞のAP活性。三つの異なるコロニーはStemgentアルカリホスファターゼ染色キットで染色。

図3：表面マーカーTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、SSEA - 3、及び核のマーカー10月4日、NanogのとSox2：ヒトiPS細胞は、以下のES細胞特異的マーカーの高いレベルを表現する。

Discussion

これらの結果は、ヒト線維芽細胞での転写因子を形質導入StemgentヒトTFのレンチセットが効率的に異所性発現を誘導することにより、iPS細胞のコロニーを生成するために使用できることを示している。プログラミングの実験を設計するとき、いくつかの変数がリプログラミングの効率を最適化するために考慮されるべきである。最初に、アクティブなウイルス対ターゲットの比率（感染MOIの多重度は）最適な導入効率を達成するために主要な情報伝達の段階で変更が必要になることがあります。第二に、標的細胞の成長条件は、リプログラミングに影響する可能性があります。健康と増殖細胞は、リプログラミングに適している。第三に、異なる細胞数のプロトコルを変更する際に、それが標的細胞数が培養皿の表面積に比例して調整することをお勧めします。最後に、このようなY27632として適用するROCK阻害剤は、最近の研究では強化ヒトESコロニーの生存にその有用性が示されたために成功したリプログラミングを確保するために考慮する必要があります^。4,5

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ヒト TF レンチウイルスセット	Stemgent	00-0005
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
TRA-1-81 抗体	Stemgent	09-0012
TRA-1-60 抗体	Stemgent	09-0009
SSEA-4 抗体	Stemgent	09-0003
SSEA-3 抗体	Stemgent	〒09-0014