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ショウジョウバエにおけるボルバキア細菌感染

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

私の名前はVoia Friedmanです。プリンストン大学の准研究員を務めています。本日は、感染したショウジョウバエの血腔から血腔液を単離し、その後、非感染のショウジョウバエにその血腔液を注入するために私が開発したいくつかのプロトコルについて説明します。基本的に、これは基礎的な目的で個体を単離するための非常にシンプルなプロトコルです。ここでは、Eチューブの上に装着できるフィルターを備えたMepo製のデバイスを使用します。まず、約100匹のハエを用意します。ハエを麻酔し、フィルターデバイスに入れます。この際、漏斗を使用するとデバイスへの投入が非常に容易になります。その後、70% ethanolで洗浄します。エタノールを取り除き、エタノールを廃棄します。3回の洗浄後、最後は超純水で洗浄してください。これは、エタノールの痕跡が残った状態で細菌を扱うことを避けるためです。その後、新しい遠心チューブに移し、マイクロ遠心機で2分間遠心分離します。その後、これを注入して、影響を受けていないハエにのみ与えます。基本的には、両面テープを使用します。通常、これらの両面テープには2つの面があり、片方の粘着力がもう片方よりも強くなっています。ハエをその上に貼り付けるため、粘着面を上に向けたままにしておきます。ガス装置において、このスライドが上にある状態ではガスの流れがなくなり、スライドの上にいるハエは覚醒します。そこで、テープを使って小さなフードや小さなチャンバーを作り、流れを直接誘導します。そして、ガスをハエの上に向かわせます。そうして、ここにテープでライトを固定すれば、ハエに処理を行うことができます。テープの上にハエを貼り付けます。すべて同じ向きにし、針を入れる方向に向けて頭を配置してください。そうすることで、翅を越えて固定でき、ハエが飛び出すのを防ぐことができます。処置中にハエが目覚めても、逃げ出さないようにするためです。そこで、ハエの尾部にある翅に、先端を軽く当てて圧力をかけるようにしてください。翅が損傷しても問題ありません。注射後にハエを取り出す際、おそらくどのみち翅は脱落しますので、生存には影響しません。それは有用です。なぜなら、ショウジョウバエを失わずに済むからです。そのため、マイクロメーターの針の後端にミネラルオイルを塗布し、その後、注入用針を挿入します。そして、圧力を調整して、材料を針の先端まで上昇させます。私は10から15 nLの間で注入しましたが、重要なのは一貫性を保つことです。ここで重要な詳細は、注入時に、針を腹部の上部まで可能な限り深く到達させる必要があるということです。ここでは、基本的に針が刺入される際に、上下に動かすためのより広いスペースが確保されています。また、基本的にクチクラに近い位置であれば、処置中に重要な臓器を貫通させる可能性が低くなります。例えば、手術を行っているフライの腸に穴を開けてしまう可能性は非常に低くなります。私はVoia Friedmanです。プリンストン大学のEric Hels研究室の准研究員を務めています。本日は、先ほどデモンストレーションでご覧いただいたこのプロトコルについてご説明します。本プロトコルは、UBAが組織を通過できることを証明するために実施されました。UBAは、地球上で最も成功している細胞内寄生虫の一つであり、20%から70%の昆虫および多くの節足動物に感染します。また、この研究は人間の疾患という点でも非常に重要です。なぜなら、オンコセルコシス（河路盲）やオンコセルコ症などの疾患を媒介する線虫にも感染するからです。そして、CCAはこれらの線虫における必須のエンドシンビオント（共生細菌）です。そのため、マラリアやデング熱のように、蚊やダニによって媒介される寄生虫性疾患を制御するための手段として、CCAを利用することに非常に大きな関心が寄せられています。このプロトコルは、基本的に、ショウジョウバエの腹腔内にCCAが存在すると、それが組織を通過して生殖細胞に到達できることを示すために開発されました。ここでご覧いただいているのはショウジョウバエの卵巣の形態であり、血リンパ中に存在すると、卵巣を包むピンク色の腹膜を通過することができます。その後、それらは筋肉層を通過します。実際、それらが卵巣内に進入する最初の場所の一つが、体細胞幹細胞イメージです。そして、そこから生殖系に到達することができます。そして、この細菌はミトコンドリアと同様に、卵子に含まれる細胞質を介して母親から伝播します。したがって、当然ながらそれらは生殖系列に存在している必要があります。それが、本プロトコルが開発された理由です。このプロトコルは非常に有用です。基本的に、従来のような方法でwBaaを感染させようとする場合、wBaaを採取して新しい昆虫種に導入することになりますが、それは通常、胚へのマイクロインジェクションによって行われます。しかし、それらの手法はより複雑です。基本的に、ここではウイルス生物学を利用しています。ウイルスは組織を通過して幹細胞組織へと移動し、生殖系列へと移行することが可能です。そのため、感染している特定の昆虫種からUBAを採取し、それを非感染種に伝播させることが容易になります。おそらく、注入操作そのものが要因であると考えられます。基本的には、ハエをできるだけしっかりと固定することに注意してください。ここでは両面粘着テープを使用しており、針を刺す際は、深く刺しすぎないよう、ハエに対してできるだけ平行かつ至近距離から刺入させる必要があります。そうすることで、手術後のハエの致死率を下げることができます。

ショウジョウバエにおけるボルバキア細菌感染

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