組織工学と細胞培養のための繊維状重合体の足場をエレクトロ

サマリー

組織工学と細胞培養のためのポリマーをエレクトロスピニングのプロセスは、この記事で取り上げられています。特に、光パターニング及びマルチポリマーエレクトロスピニングの追加の処理能力を持つ光反応性マクロマーのエレクトロスピニングが記載されている。

要約

組織工学の分野が発展するにつれて、より複雑な臓器や組織の要件（例えば、力学と血管）に対処するために、より適切な素材と加工技術を生成するために非常に大きな需要があります。エレクトロスピニングは、ネイティブの細胞外マトリックスのアーキテクチャと大きさのスケールを模倣繊維状足場を作成するための一般的な手法です。繊維が細胞挙動を指示するために使用することができるので、これらの繊維状の足場は、幹細胞の分化（Mauckによる大規模なレビューをすべて見る含め、また、細胞培養の基質として有用である

プロトコル

A.単一のポリマーエレクトロスピニング

1. エレクトロスピニング溶液を調製する前に、数日間37℃で溶解して脱イオン水でイルガキュア2959（I2959）、、光開始剤の0.5重量％溶液を作る。光反応性ポリマーが使用されていない場合、この手順は必要ありません。
2. 2重量％MeHA、3重量％の最終濃度で溶液を調製メタクリル化ヒアルロン酸（MeHA、バーディックらを参照してください。合成のため）、ポリ（エチレンオキシド）（PEO、900 kDaの）、および脱イオン水でI2959を組み合わせるPEO、および0.05重量％I2959。それが透明になるまで溶液を混合するために渦を使用してください。ポリマーの種類および濃度、ならびに使用される溶媒は、所望の足場の特性に応じてこのステップで変更することができます。
3. シリンジに液を移し、最後に18ゲージ、長さは6インチ、平滑末端の針を取り付けます。
4. 1.2 mLの/ hrの速度で排出するプログラムシリンジポンプ。デバイスへの注射器と針を挿入します。
5. 収集装置に高電圧電源の接地リード線を取り付けます。ランダムに分散した繊維は平らな金属板を使用して収集し、または整列繊維を収集するために〜10 m / sで回転するマンドレルを使用する。針に正に帯電したリードを取り付けます。エレクトロスピニング装置の概略図1を参照してください。
6. 、両者の間を15cmの距離があるような針や収集装置を調整します。
7. シリンジポンプの流量を開始します。流体が針の先端に視覚化されるときは、電源をオンにし、22 kVに電圧を設定します。
8. コレクションは、（薄膜の数分から、最大厚いマットのための24時間まで）の完了後、収集装置から足場を削除し、溶剤の完全除去を確実にするために一晩真空下で保管してください。
9. 走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて繊維の形態を視覚化する、代表的な足場が整列し、非整列の両方の構造については図1に示されています。

注：サンプル流量、収集装置までの距離、および電圧は、ポリマーと溶媒の組み合わせに依存しており、通常はSEMで足場の形態を観察することによって、各システム用に最適化されている必要があります。

B.の光架橋と光パターニング

1. 足場のマットから5mm × 5mmの試料を切り出した。
2. きれいなスライドガラスで覆うとバインダークリップで両端をクリッピング、足場上で直接フォトマスクを配置し、スライドガラスをカバーフォイルで各足場を置くことによって、架橋のために準備する。注：4つのサンプルは一度に行うことができる、とパターンが必要ない場合は、パターンのない透明性、架橋のために使用することができます。
3. パージ足場は、窒素のチャンバー内に設定します。架橋を阻害することができる酸素、より構造がフリー状態にしておくことが重要です。
4. 5分間コリメートアダプター付き〜10 MW / cm ^2の 365nmの光の下で窒素チャンバ内の場所に足場のセットアップ。 図2の回路図を参照してください。
5. 各足場を取り外し、12ウェルプレートの場所。
6. 37水と場所の蒸発を防ぐために、各ウェルに精製水2 mLをパラフィルムプレート追加℃で24時間。水を3回変更してください。
7. 光学顕微鏡下で孔形成を可視化する（ 図2の例を参照）。足場は、使用する準備は完了です。

注：光架橋は、ポリマーの多くの種類のために必要ではない、しかし、光パターニングは、光反応性ポリマーを使用することができます。

蛍光ファイバーの可視化とC.デュアルポリマーエレクトロスピニング

1. 90％エタノールでPEO（200 kDa）の5重量％の溶液を調製します。 50℃より前のエレクトロスピニングに少なくとも2時間、700 rpmで攪拌​​。
2. シリンジにPEOのソリューションを移し、エレクトロスピニング溶液中に10 mg / mLの濃度の最終濃度のためにDAPIを追加。光から保護するために、アルミホイルでシリンジを包みます。
3. また、エレクトロスピニング溶液中で25μMの最終濃度methacryloxyethylチオカルバモイルローダミンB（MeRho、683.24グラム/モル）を追加する場合を除き、ステップA2で説明した同じ溶液を調製します。光から保護するために、アルミホイルでシリンジを包みます。
4. 注意深くマンドレルの表面にメタクリルガラス製カバースリップを（Khademhosseini らを参照してください。）確保するためにスコッチテープを使用してください。注：繊維は、メタクリルガラス製カバースリップに縛らになります。
5. シリンジのいずれかにルアーロックの添付ファイル付きのシリコンチューブの5 mm長部分の一端を添付して、針にもう一方の端を取り付けます。シリンジポンプにシリンジを挿入し、送風機の穴から針を刺します。マンドレルの反対側のサイト上で他の注射器とあおぐ人で繰り返します。 fannersはlを翻訳マンドレルのengthと結果足場の両方のポリマーの平等な分配を確保するために使用されています。 図3の回路図を参照してください。
6. 適切に表1にしたがってセクションで説明されているパラメータを調整します。針の先端がマンドレルを中心にされていることを確認します。
   
   表1。デュアルポリマーエレクトロパラメータ
   

   注射器	ニードルチップ（cm）にあおぐ人	マンドレル（cm）に針の先端	流量（mLの/時）	印加電圧（kV）の
   MeHA	6	15	1.2	22
   PEO	6	10	1.2	15

   
   
7. すべてが適切に配置されると、ライトをオフにしてマンドレルとシリンジポンプをオンにします。シリンジからアルミホイルを取り外します。流体は、両方の針の先端上に表示されているときに、同時にfannersでの電源とプラグをオンにします。
8. 収集が完了すると、電源装置とマンドレルをオフにしてfannersを抜いてください。慎重にカミソリの刃を使用してカバースリップとテープを取り外します。
9. ローダミンおよびDAPI用フィルターを装備した蛍光顕微鏡を用いて繊維を可視化する。 図3の例を参照してください。注：蛍光繊維は、短期間（<3分）のためのエレクトロスピニングは、しかしながら、このプロセスは、特にガラス製カバースリップを使用せずに、厚い構造を作成するために時間を無制限に拡張することができるときに表示するには、最も明確である。

足場上でD.シーディングセル

1. 適切なサイズのウェルプレートの個々のウェルに接続されているエレクトロポリマーを使用して各カバースリップを配置。注：繊維と細胞間相互作用は、メタクリルガラス製カバースリップの上にエレクトロスピニングによって簡単に表示されている。また、MeRhoは再び繊維の可視化に使用することができます。
2. 溶剤の完全除去と副産物すべての可能な浸出性を確保するために一晩PBSで足場をインキュベートする。
3. 井戸からPBSを削除します。
4. 足場を殺菌するために、30分間層流フードで殺菌灯の下に配置します。完全な足場はシードされている場合、別の30分間殺菌灯の下で上の足場と場所を反転させる。
5. 標準細胞培養を行い、（例えば、6,000細胞cm ^-2）の所望の細胞密度で濃縮された細胞懸濁液を準備する。例えば、22㎜× 22 mmのカバースリップのために細胞懸濁液100 mLを使用してください。 1時間培養器に置きます。
6. 各ウェルに細胞培養培地の適切な量を追加。インキュベーターに戻して足場を置きます。
7. 市販のライブ/デッドキットを用いて細胞を染色。注：このようなDAPI​​（細胞核）と蛍光標識ファロイジン（アクチンストレスファイバー）などの細胞の染色の他のタイプは、細胞を可視化に適用することができます。
8. TRITCおよびFITC用のフィルターを装備した蛍光顕微鏡を用いて細胞と繊維を可視化する。 図4の例を参照してください。

代表的な結果：

図1非整列足場の形成（上）とアライン足場の形成（下）のデバイスのセットアップを示す回路図。足場の各タイプの例走査型電子顕微鏡の画像が表示されます。スケールバー=5μmの。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

図2。パターニング方法の概略図。パターンは、光架橋時の光源と足場の間にフォトマスクを配置し、離れて未反応のポリマーを洗浄することによって形成される。孔形成および凍結乾燥後の足場のフォトマスクとSEM像。スケールバー= 100μmの。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。

図3マルチポリマーエレクトロの設定と必要な処理パラメータの回路図、ならびに2つのファイバの集団（例：赤MeHAと青PEO）の混合物の代表的な蛍光画像のマルチポリマー足場を形成するために同時にエレクトロスピニングされた。スケールバー= 100μmの。してくださいここをクリックして大きい版？を参照する図3のn。

図4ヒト間葉系幹細胞とエレクトロの繊維との相互作用の例デッド/ライブ染色像。スケールバー= 100μmの。してくださいここをクリックして図4の拡大バージョンを参照すること。

ディスカッション

エレクトロスピニングは、高分子から繊維質足場を準備するために使用されていました。ヒアルロン酸に基づいて光架橋の足場は、露光が架橋のために必要とされる説明の例として使用した。このようなMeHAような反応性マクロマー、を使用すると、以前に強化された細胞分布を実証しているチャンネルは、マクロとミクロ多孔足場を形成する光架橋時のマスクを用いて足場に編入された。また、二つの異なるポリマーが、同時に私たちのカスタム装置を用いてエレクトロスピニングされた。二つの異なる繊維の集団の存在は、後に蛍光顕微鏡を用いて表示された各エレクトロソリューションへの蛍光色素を加えて検証した。マルチポリマー足場は細胞分布だけでなく、単一の高分子エレクトロの足場からの相対特定のアプリケーションのためのより良い調整力学と足場の劣化を促進するために使用することができます。さらに、足場の滅菌と細胞播種が実証されています。これらの手法の多くは汎用性がありますし、組織工学および細胞の培養のためのアプリケーションのための多様な足場を製造するために、異なるポリマーの範囲に使用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DAPI	試薬	Invitrogen	D1306
I2959	試薬	Ciba Specialty Chemicals
PEO 200 kDa		Polysciences, Inc.	17503
PEO 900 kDa	試薬	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	試薬	Polysciences, Inc.	23591-100	DMSOでストック溶液を調製する
Live/Dead Stain Kit	試薬	Invitrogen	L3224	Calcein（生存細胞を緑色に染色）およびエチジウムホモダイマー（死細胞を赤色に染色）を含む
シリンジポンプ	機器	KD Scientific	KDS100	デュアルポリマー紡糸には2台必要
電源	機器	Gamma High Voltage	ES30P-5W	デュアルポリマー紡糸には2台必要
モーター	機器	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	カスタム製作のマンドレルに取り付ける必要がある
タコメーター	機器	Network Tool Warehouse	ESI-330	マンドレルの回転速度の監視に使用する
コリメートアダプター付きOmnicure UVスポットキュアシステム	機器	EXFO	S1000
シリコーンチューブ	機器	McMaster-Carr	51135K151
ルアーロックメスアダプター	機器	McMaster-Carr	51525K293
ルアーロックオスアダプター	機器	McMaster-Carr	51525K143
ニードル	機器	Fisher Scientific	14-825-16H
カバーガラス	機器	Corning	2875-22