サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

サマリー

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの特異性と堅牢性を犠牲にすることなく、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計された斬新なデザイン済みの定量PCRプライマー/プローブの組み合わせです。

要約

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの感度および精度を維持しながら、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計されたプライマー/プローブセットの新しいタイプです。これらのプライマー/プローブセットは、以前は利用可能な技術からヒトとマウスのゲノムと機能の大幅な改善の> 98％に予め設計されています。これらの改善は、サーモフィッシャーサイエンティバイオインフォマティクスの専門家によって開発された斬新なデザインのアルゴリズム、のおかげで可能にした。

いくつかの便利な機能が定量的リアルタイムPCRを行うのプロセスを合理化するためのSolaris定量PCRアッセイに組み込まれています。最初に、プロトコルは、一般的に用い選択肢に似ていますが、その定量PCR中に使用される方法は精通している可能性があります。第二に、マスターミックスは、追跡するために、定量PCRの反応は、設定を容易になる、青です。第三に、熱サイクル条件は、すべてのアッセイ（遺伝子）、それは可能な限り一度に多くのサンプルを実行することやエラーの可能性を減少させるための同じです。最後に、プローブとプライマーの配列情報は、公開プロセスを簡素化、提供されています。

ここでは、ご注文のウェブサイト（www.thermo.com / Solaris）上で、どのように標準曲線法を用いてqPCRを行うためのSolarisの試薬を使用するために見つけたGENEius製品検索機能を使用して適切なSolarisの試薬を取得する方法を示します。

プロトコル

1。サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRのアッセイデザインアルゴリズム

1. Solarisの定量PCRプローブ/プライマーペアの設計で使用されるアルゴリズムは、それによって普遍的なサイクリングの条件を可能にする各コンポーネントのTmを調整します。 MGBの定款、または副溝結合、プローブの部分は、Tmを増加させ、より大きなアッセイの柔軟性とパフォーマンスのために設計されるため、より短いプローブすることができます。その名前が示すように、MGBsはDNAのらせんの副溝に収まることができる抗生物質のクラスです。 MGBsは、DNAプローブの3または5の端に添付されます。ソリューションでは、プローブのFAMのレポーターの蛍光は、Eclipseダーククエンチャーによりクエンチされる。プローブが標的配列に結合すると、プローブの3次元立体構造の結果としての変化は、強い蛍光シグナルを可能にします。標的配列のDNAプローブの結合は、PCRのための適切な溶融温度を維持しながら、高度に特異的な、より短いプローブの使用を可能にするMGB、によって安定化される。このように、信号検出は、ターゲットの増幅のアニーリング相の間に発生します。拡張ステップの間、MGBプローブは、関連付けを解除して、蛍光は再び急冷する。プローブがアソシエーションを解除するので、それはPCR効率には影響しません。
2. Solarisのアルゴリズムのもう一つの特徴は、Superbasesの使用です。 Superbasesは、債券ATの安定性を向上させ、GGグアニンに富む配列における自己会合を排除するための結合能力を強化している拠点を変更されます。また、彼らは、5末端に接続された隣接する蛍光物質を消光しない。これらの塩基を選択的に標的配列の可用性を拡張するために、アルゴリズムにしたがって、配置されます。これは、そうでない場合はプライマーとプローブを設計する際に避けられるようなGCリッチな領域として配列が、使用することが可能になります。
3. 可能な限り、Solarisのアルゴリズムは、ターゲットサイトのエキソン接合貫通領域を内蔵しています。これは、汚染物質ゲノムDNAの増幅を回避することによって特異性を向上させます。
4. 重要なのは、このアルゴリズムは、すべてが単一のプローブ/プライマーセットによってカバーされるような既知のすべてのスプライスバリアントのためのコンセンサス配列を、識別する。そう、唯一のアッセイは、興味のある特定の遺伝子のために必要です。
5. 最後に、Solarisの定量PCRアッセイの設計アルゴリズムは、GC含量、長さ、Tm値、および均一なヌクレオチドのストレッチなどの重要な設計上の考慮事項のための非常に厳しいパラメータを利用しています。ゲノム、トランスクリプト、および偽遺伝子：結果のシーケンスは、3つの異なるデータベースを使用して特異性のために分析BLASTです。

2。 Solarisの試薬の入手方法

1. 適切なSolarisの試薬 ​​を入手するには、 www.thermo.com / Solarisを
2. 一度Webサイトで"GENEius商品検索"をクリックしてください。 GENEius製品検索へ直接移動するには、を参照してくださいwww.thermo.com / SolarisSearch
3. 検索照会ボックスをクリックし、適切な標的生物を選択してください。
4. GENEius製品の検索は、多くの異なる遺伝子の識別子を処理することができます。ここでは、文献[シーケンシャルアク、遺伝子ID、遺伝子シンボル、遺伝子情報、サンガーのIDまたはアクセッション番号、またはカタログ番号を含む、対象の遺伝子を見つけるために提案された検索用語、のいずれかを入力します。その後、"検索"をクリックしてください。
5. 目的の遺伝子を特定し、左側の"選択"をクリックしてください。これは、目的の遺伝子のために利用可能な異なるサーモサイエンティフィックの製品を表示するウィンドウを開きます。 "製品"の下に"定量PCRの検出"タブを選択します。
6. 見出しの"Solarisの遺伝子発現アッセイ"の下に、最適にSolarisのプローブ/プライマーアッセイを設計したものが表示されます。このアッセイは、遺伝子のターゲットのすべての既知のスプライシングバリアントをカバーします。希望する数量を選択してください。彼らは、100、200、400で提供され、
   1000 X 25μlの反応（アッセイはオーダーメイドとして識別されている場合、100枚サイズは使用できなくなります）。 "カートに入れる"をクリックしてください。
7. 次に、使用するサーマルサイクラーに適したマスターミックスを選択します。マスターミックスが可能なマシンで最適に動作するかを決定するために、クリックして"マスターミックスは、PCRのサーマルサイクラーで最適な動作するこちらをご覧ください。"
8. 使用するミックスを決定するためにメニューに使用される定量PCRのサーマルサイクラーを見つける。
9. GENEius製品の検索ウィンドウに戻り、適切なマスターミックスを選択します。マスターミックスは、100、200、400、および1000反応のサイズがあります。 "カートに入れる"をクリックします。
10. 推奨リファレンス遺伝子と裏面cDNA合成キットは、完全な定量RT - PCR分析のために注文することができます。
11. Solarisの定量PCR試薬が到着すると、使用直前まで-20℃で保管します。以下の試薬を受信する必要があります：色曲、800 nMの各、200 nmで提供されて一つの遺伝子特異的プローブで提供されている2つのプライマーを含む20倍ソリューションをプローブとプライマー、および2Xの濃度でのSolaris定量PCR遺伝子発現のマスターミックスの両方のレンス情報。 Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、12ヶ月以上安定しています。融解凍結を避けてください。

3。定量PCRセットアップ

1. cDNAを定量PCRのプロトコルを開始します。トータルRNAをスピンカラム法を用いて抽出する必要があります。サーモフィッシャーサイエンティヴァーソcDNA合成キットはcDNAを生成するために逆転写することをお勧めします。
2. プライマー、プローブ、およびマスターミックスを氷上で融解することによって定量PCRの準備。また、リアルタイムPCRの感度を向上させることができる手PCRグレードの水と不透明な白の定量PCRプレート、上持っている。
3. 1）サーモスタートDNAポリメラーゼ、Thermoprime DNAポリメラーゼのホットスタートバージョン：マスターミックスには含めてリアルタイムPCR用のすべてのコンポーネントが含まれています。ポリメラーゼのこのタイプは、最大反応、設定し、95℃で15分で活性化工程を必要とする時の非特異的増幅を防ぐために使用されます。 2）SolarisのマスターミックスでのdNTPは、dTTPのは、Solarisのプライマー/プローブアッセイで動作するように最適化された独自の反応緩衝増幅効率3）を、最大化するためにdUTPを置き換えます。この反応バッファー、試薬とプラスチックの間のコントラストを高めるために青色色素が含まれています。あなたの定量PCR装置がROX必要とする場合4）ROX、。
4. ソリューションが融解した後、チューブを（ボルテックスしない）フリックで混ぜる。試薬の損失を防ぐために、それらをスピンダウン。
5. 次に、サンプル数に応じてスケールアップ、反応の目的遺伝子の組み合わせに加え、リファレンス遺伝子の1つを設定するために15 mLの滅菌ファルコンチューブを準備する。十分な三人レプリケートするよう準備を標準曲線法は、分析のために使用される場合は、テンプレートのコントロール（NTC）と標準曲線のサンプルを含むため、個々のサンプルを用意することができます。
6. 96ウェルプレート上で実行される各サンプルについて、以下のミックス：最終反応容積こと2XのSolaris定量PCRマスターミックス、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）、およびそのようなPCRグレードの水の0.5μlの5μLを、一度cDNAを25μLとなる追加されます。 384ウェルプレート上で実行される各サンプルに対して次のように混在させる：2XのSolaris定量PCRマスターミックスの12.5μL、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）の1.25μL、およびそのようなPCRグレードの水を最終反応容量、一回のcDNAその10μLとなる追加されます。
7. マルチチャンネルピペッターを使用して、プレートの適切なウェルにマスターミックスを転送する。マスターミックスに含まれる青い色素は、白色プレート上にピペットで進捗状況を追跡する際に役立ちます。その後、1-5μLのcDNAテンプレート（96ウェルプレートの場合）またはcDNAテンプレートの1〜2μLを（384ウェルプレート用）を追加。ミックスを上下にピペッティングし。遠心分離機にプレートを置き、これらの蛍光測定値に干渉するので、任意の気泡を除去するためにスピンダウン。
8. プログラムは、サーマルサイクラー：酵素は95℃15分（1サイクル）でアクティブにする必要があります。 95その後40サイクル60℃℃、15秒間の変性、及びアニーリングおよび伸長℃（60秒）。
9. 定量PCR機器にプレートを置きます。プログラムを起動します。

Solarisを使用して代表的な定量PCRの結果

図1 PCRの効率とr2の値で判断してSolarisのアッセイは、非常に低い入力濃度で信頼性の高い検出を与える。合成RNAアンプリコン配列またはDNAのアンプリコン配列から合成したcDNAの十10倍希釈液をそれぞれF2RL1またはCDC20、のためのSolaris定量PCRの遺伝子発現アッセイを用いてABI 7900HT楽器で増幅した。対数増幅曲線と標準曲線は、効率性、R2の値は、10 log10の希釈液の外ダイナミックレンジ、および検出の下限値を含む各アッセイの性能と一緒に表示されます。

図2 Solarisのアッセイは、さらに別の研究者と研究所間の一貫性のある結果を与える。 ALDOAとPPIBだけでなく、非標的コントロール（NTC）をターゲットにしたsiRNAは、100、10、1、0.1 nMの終濃度でHeLa細胞にトランスフェクションした。細胞を採取し、全RNAは、48時間後の治療を単離した。 cDNAは、サーモフィッシャーサイエンティヴァーcDNA合成キットを用いて合成した。 cDNAのアリコートをロシュクラー480（384）プラットフォーム上でALDOA、PPIB、およびGAPDHの検出のためのSolaris定量PCR遺伝子発現アッセイを使用して、2つの地理的に離れた研究室で増幅した。ノックダウンはΔΔCq法（GAPDHリファレンス遺伝子とNTC処理細胞に規格化）を用いて算出した。ノックダウンの同じレベルは、両方のサイトの両方の研究者との間の遺伝子標的の両方で実証された。

ディスカッション

サーモサイエンティフィックのSolaris qPCRアッセイは、qPCR解析を実行するための簡単​​な、改良された方法を提供する。 MGB技術とSuperbasesを組み込んだ、高ストのアルゴリズムを使用して、これらプライマーおよびプローブセットは、定量PCR実験の忠実性と堅牢性を最大化する。一のプライマーおよびプローブセットは、特定の遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを認識する。ターゲットサイト、可能な限りは、ゲノムDNAが増幅されていないことを保証するために、エクソンにまたがる領域を含む。これらの機能は大幅に複雑な実験を実行するために必要な時間の量を減らすこと、同時に多数のサンプルを実行することが可能に。マスターミックスは青なので、ピペッティングのトラックを失うことなく、定量PCRの感度を向上させる白色不透明プレートを、使用することが可能です。

すべて一緒になって、Solarisの定量PCRアッセイのデザインの特徴は、この小説定量PCRアッセイの特定と、堅牢かつシンプルな、まだ高性能なアッセイを行う。