このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

Summary

の可視化<em> in vivoで</em> RNAのトランスポートは、蛍光標識RNA転写物のマイクロインジェクションによってに行われます<em>アフリカツメガエル</em>卵母細胞、共焦点顕微鏡に続く。

Abstract

RNAの局在は、細胞極性の確立に保存されたメカニズムです。 VG1 mRNAはアフリカツメガエルの卵母細胞と空間的にVG1蛋白質の遺伝子発現を制限する行為の植物極に局在化する。この方法でVG1分布の厳密な制御は、発生中の胚の適切な胚層の仕様が必要です。 mRNAの3'UTRのRNA配列の要素は、VG1ローカライズ要素（VLE）は必須と直接輸送するのに十分です。 in vivoで VG1 mRNAの認識と輸送を調べるため、我々は、単純な視覚的な読み出しを経由してトランスファクター向けトランスポートメカニズムの広範な分析を可能にするイメージング技術を開発した。

RNAの局在を可視化するために、我々は、蛍光標識VLEのRNAを合成し、個々の卵母細胞にその写しを顕微注入する。注入されたRNAの輸送を可能にするために卵母細胞の培養後、卵母細胞は、前の共焦点顕微鏡によるイメージングに固定し、脱水です。 mRNAの局在パターンの可視化は、RNAのトランスポートの完全な経路を監視し、シス作用転写内の要素とVLEに結合するトランス作用因子のためにRNAの輸送を指示するの役割を識別するための読み出しを提供する（ルイスら、2008、 Messittら、2008）。我々は、追加のRNAやタンパク質（ギャニオンとモウリー、2009年、Messittら、2008）との共局在を介し​​てこの手法を拡張しており、モーター蛋白質の崩壊と細胞骨格との組み合わせで（Messittら、2008）プローブにmRNAの局在のメカニズム。

Protocol

パート1：蛍光標識mRNAの転写。

1. RNAの局在化の要素や他の関連配列を含むプラスミドDNAを線形化し、DEPC処理H _{2 O}での1μg/μLで再懸濁します。 DNAテンプレートは、T7、SP6、またはT3 RNAポリメラーゼによる転写のための上流のプロモーター部位を持っている必要があります。
2. 滅菌1.5mlチューブに下記の試薬を追加します。

   A. 10X送信バッファ（M＆Mを参照）	2μlの
   B. 20Xキャップ/ NTPミックス（M＆Mを参照）	1μL
   C. 1mMののAlexa Fluor ® 546から14 – UTP（Invitrogen社）	1μL
   D. UTP、[α- 32 P]（1μCiの/μL）（パーキンエルマー）	1μL
   E. DEPC – H 2 O	11μlの
   F. 0.2 M DTT	1μL
   G. RNasin（プロメガ社製）	1μL
   H.リニアテンプレートDNA	1μL
   I. RNAポリメラーゼ（プロメガ）	1μL

3. 静かに試薬を混合し、（10秒。微量遠心機で）短時間遠心します。
4. フルオロフォアの光退色を防ぐためにアルミホイルでチューブをカバーし、37℃で2〜4時間インキュベートする。
5. 鋳型DNAを分解するために1μlの1 mg / mLのRNaseフリーのDNase（プロメガ）を追加します。
6. 37℃で15分間インキュベーション℃に
7. 反応を停止するには79μlの20 mMのEDTA（pH 8.0）を追加します。
8. "入力"して保存とラベルを別々のチューブに1μlを取り外します。
9. 全長のmRNAを排除しながら取り込まれなかったヌクレオチドを​​含んでなる1ミリリットルG50カラムを介してスピンの反応（材料と方法を参照）、。
10. エタノール沈殿によりRNAを濃縮する。
    1. 250μlの100％エタノール、10μlの7M CH ₃ COONH _4、1μlのキャリアRNA（酵母tRNA、10μg/μLの）または1μlのグリコーゲン（20 mg / ml）を追加。
    2. よく混ぜ、-80℃で> 30分間または15分間ドライアイス上で固体になるまで凍結する。
    3. 15分、上清をデカント用遠心機で最高速度で回転する。
    4. 75％エタノール150μlで洗浄する。
    5. 遠心、上清をデカントで最高速度で3分間スピン。
    6. 37℃で3分間のペレットを乾燥させ、すべてのエタノールが蒸発していることを保証する。
11. 11μlのDEPC – H ₂ Oに再懸濁し、"組み込まれた"とラベルを別々のチューブに1μlを削除します。
12. パーセントの混入を決定し、50 nMの（計算のための材料と方法を参照）にRNAを希釈する。
13. RNAは凍結/融解を避けるために、単一の使用のために、5μlのアリコートで凍結する必要があり、-80℃で数週間保存することができます

第2部：マイクロインジェクションのための準備。

1. RNAの調製：
   RNA（50 nm）のアリコートを解凍し、70℃RNAを変性° Cを3〜5分間。任意の粒子を除去し、氷の上に保つために最高速度で室温の遠心機で10分間スピン。
2. 卵母細胞の準備：
   1. 外科的にアフリカツメガエルの雌（ナスコ）から卵巣を摘出する。
   2. コラゲナーゼ溶液25 mlを入れた50 mlコニカルチューブにアフリカツメガエルの卵巣のトリム部分（材料と方法を参照）。
   3. 15分間18℃で穏やかに振盪、または卵母細胞まで目に見えて卵巣から分離されています。バッチの変動にバッチに起因する、コラゲナーゼ処理時間が異なる場合がありますとdefoliculationを確保するために目視検査によって慎重に監視する必要があります。
   4. 卵母細胞が、管に定着液を除去し、MBSHバッファ（材料と方法を参照）で卵母細胞を洗浄することができます。
   5. 3回の洗浄の合計のためにさらに2回洗浄を繰り返します。この卵母細胞の単離プロトコルは、Cohenら、2009年にはその詳細と似ています。
   6. 標準的な解剖顕微鏡下MBSHバッファに手動でソートステージIII / IVの卵母細胞（デュモン、1972）。 IV期の卵母細胞は、顔料とわずかに大きく、斑点のある間III期の卵母細胞は、完全に不透明ですが白です。わずかに透明な卵母細胞は、完全に色素沈着や展示偏光顔料の分布が古すぎることは若すぎると卵母細胞です。
3. 針の準備：
   〜0.05 mmの外径に針を引いて、ベベル。 （私たちは、ドラモンド科学3.5インチ毛細血管（オーダー＃3 – 000 – 203 – G / X）、サッターインストゥルメント（株）マイクロピペットプラーとWPI社bevellerを使用してください。）

パート3：マイクロインジェクション

1. 注入あたり2 NLを提供するDEPC – H ₂ Oで針をキャリブレーション。我々は、フロントガス駆動型マイクロインジェクターを（材料と方法を参照）を使用して、私たちの針をロードし、マイクロメータを使用してドロップサイズを校正する。
2. 針にRNAをロードする。
3. MBSHバッファーを含有する注射剤の皿にソートされた卵母細胞を置きます。私たちは、黒い発泡ゴムの層で皿の上に顕微注入する。薄い卵母細胞は白backgrouでよく目立つND。
4. 慎重には50nMでのRNAの2 NLで各卵母細胞を注入する。
5. 、RNA追放するDEPC – H ₂ Oで針をすすぎ、および注入のために、次のRNAをロードする。

パート4：卵の文化

1. 滅菌24ウェルプレート（シグマアルドリッチ社）のウェルにおける場所の卵。ウェルあたり千卵母細胞への我々は、文化まで。
2. バッファを削除し、400μlのO ocyte C ulture M ediumと交換してください（OCM、材料と方法を参照してください）ウェル当たり。培養中に湿潤環境を維持するためにぬれたペーパータオルで気密プラスチック容器内の培養プレートを配置。
3. 18℃で8〜48時間までの間の時間ポイントのために卵母細胞をインキュベートする。

パート5：卵母細胞の固定、脱水とストレージ

1. ガラスバイアルに卵母細胞の生存、デッド卵母細胞と場所を整理する。我々は日常的に> 90％の生存率を観察。
2. 20分間MEMFA固定剤（材料と方法を参照）と岩の場所は、卵母細胞。アルミホイルで覆うことにより、光から卵母細胞を保護する。
3. 固定液を除去し、MBSH等量のバッファーと置き換えることにより、卵母細胞を洗浄してください。 2回の洗浄の合計のためにもう一度この洗浄を繰り返します。
4. 無水メタノール中に卵母細胞を洗う。
   1. ボリュームの半分を削除し、メタノールで交換してください。
   2. 二度""手順を繰り返します。
   3. ソリューションのすべてを削除する、メタノールで交換してください。
   4. メタノール洗浄を繰り返します。
5. 卵母細胞は、画像への準備ができるまで-20℃で保存することができます。

パート6：共焦点顕微鏡によるイメージングRNAの局在

1. イメージングの前に、撮像面をカバーするガラス底FluoroDish（WPI社）にマレーのクリアミディアム（2:1安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール）を追加します。
2. 慎重に転送されるメタノールの量を最小限に抑え、メタノールからFluoroDishに卵母細胞を移す。
3. 倒立型共焦点顕微鏡でのイメージ（我々が正常にツァイスLSM510とライカTCS SP2を使用している）。

図1：蛍光標識転写産物のマイクロインジェクションによる細胞内RNAの局在の可視化A.以下のマイクロインジェクションは、のAlexa Fluor 546で標識されたRNAは、最初は核に限定されているB.は、培養8時間後、蛍光標識されたコントロールRNAが均一に見ることができます。卵母細胞の細胞質に分布する。C.は、しかし、輸送用機械を採用する配列を含む蛍光標識したRNAは卵母細胞の植物極（下部に向かって）への細胞内局在性の過程で見ることができます。スケールバー= 50μmの。

Discussion

ここでは、 アフリカツメガエルの卵母細胞におけるmRNAの局在を可視化するためのプロトコルを提示している。蛍光標識RNA転写物を使用して、このメソッドは、以前にジゴキシゲニン標識転写産物を得て、より簡単かつ迅速にその場ベースのアプローチよりもよりも、対ノイズ比の高い信号（モウリーとメルトン、1992、ガウトリューら、1997）があります。この方法を使用して、我々は、RNA配列の変異をエンジニアリングし、急速に生体機能のためにテストすることができます。さらに、追加のアレクサ- UTPのフルオロフォアを使用することにより、複数のRNA種が同一の卵母細胞で可視化することができる。我々は、理由488nmの波長範囲における自家蛍光のAlexa ® 488 – 5 – UTPと比較して、 アフリカツメガエルの卵母細胞でのAlexa Fluor ® 546から14 – UTPは優れた結果を示すことを発見したが、2つのRNAの二重像はそれにもかかわらず可能です（ガニオンをとモウリー、2009）。また、この手法は、タンパク質の共局在を検出するための免疫染色のプロトコルと組み合わせて、うまく機能互換性のある蛍光二次抗体の多種多様なとして（ユンとモウリー、2006年、Messittら、2008）ご利用いただけます。最後に、ドミナントネガティブ因子または小分子干渉の過剰発現を介してRNAの局在化のプロセスの中断は、mRNAの局在経路に微妙な欠陥を（Messittら、2008）視覚化するために、このアッセイと組み合わせることができます。この手法は、in vivoでのmRNAの分布を検出するための比較的単純で堅牢なアッセイであることが証明されているとmRNAの輸送のメカニズムをプロービングするために、既存の生化学、分子生物学および細胞生物学的手法に容易に統合することができます。

Materials

<p class="jove_content"><strong>10X Tx buffer</strong></p>

<ul> <li class="none">60 mM MgCl<sub>2</sub></li> <li class="none">400 mM Tris-HCl (pH 7.5)</li> <li class="none">20 mM spermidine-HCl</li> </ul>

<p class="jove_content"><strong>20x cap/NTP mix</strong></p>

<ul> <li class="none">10 mM CTP</li> <li class="none">10 mM ATP</li> <li class="none">9 mM UTP</li> <li class="none">2 mM GTP</li> <li class="none">20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)</li> </ul>

<p class="jove_content"><strong>G-50 column</strong></p>

<ul> <li class="none">Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H<sub>2</sub>O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:</li> <li class="none">0.5 ml 0.2 M EDTA</li> <li class="none">1 ml 1 M Tris pH 8.0</li> <li class="none">0.5 ml 20% SDS</li> <li class="none">Store complete G-50 solution at 4 &deg; C.</li> <li class="none">Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).</li> <li class="none">Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.</li> <li class="none">Add 2 ml G-50 solution to the empty column.</li> <li class="none">Spin for 1 minute at 1,000 x <em>g</em> in benchtop centrifuge.</li> <li class="none">Add 200 &mu;l DEPC-treated deionized H<sub>2</sub>O to each column. Spin.</li> <li class="none">Repeat wash twice more for a total of three washes.</li> <li class="none">Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.</li> </ul>

<p class="jove_content"><strong>Collagenase solution</strong></p>

<ul> <li class="none">75 mg collagenase from <em>Clostridium histolyticum</em> (Sigma Aldrich)</li> <li class="none">25 ml 0.1 M KPO<sub>3</sub>+ (pH 7.4)</li> </ul>

<p class="jove_content"><strong>MBSH buffer</strong></p>

<ul> <li class="none">88 mM NaCl</li> <li class="none">1 mM KCl</li> <li class="none">2.4 mM NaHCO<sub>3</sub></li> <li class="none">0.82 mM MgSO<sub>4</sub> X 7H<sub>2</sub>O</li> <li class="none">0.33 mM Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub> X 4H<sub>2</sub>O</li> <li class="none">0.41 mM CaCl<sub>2</sub> X 6H<sub>2</sub>O</li> <li class="none">10 mM HEPES (pH 7.6)</li> </ul>

<p class="jove_content"><strong>Oocyte Culture Medium</strong></p>

<ul> <li class="none">50% L15 medium</li> <li class="none">15 mM HEPES (pH 7.6)</li> <li class="none">1 mg/ml insulin</li> <li class="none">100 mg/ml gentamicin</li> <li class="none">50 U/ml nystatin</li> <li class="none">50 U/ml penicillin</li> <li class="none">50 mg/ml streptomycin</li> </ul>

<p class="jove_content"><strong>MEMFA solution</strong></p>

<ul> <li class="none">0.1 M MOPS (pH 7.4)</li> <li class="none">2 mM EGTA</li> <li class="none">1 mM MgSO<sub>4</sub></li> <li class="none">3.7% formaldehyde</li> </ul>

<p class="jove_content"><strong>Computing RNA yield</strong></p>

<ul> <li class="none">Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter.</li> <li class="none">incorporation = ("incorporated") / (10 x "input")</li> <li class="none">Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.</li> <li class="none">Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 – 2.64 &mu;g</li> <li class="none">Reaction yield in &mu;g = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)</li> <li class="none">Dilute RNA to 50 nM = (&mu;g RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10<sup>-8</sup>)</li> <li class="none">The reaction usually yields ~50-100 &mu;l of RNA at 50 nM.</li> </ul>