の電極の作製と注入アメフラシカリフォルニ無傷、自由に振る舞う動物における多チャンネル神経と筋肉の録音のための

サマリー

テクニックは、4を注入するために記述されています in vivoで電極の摂食行動の神経筋制御を監視するアメフラシカリフォルニ。

要約

の主要な神経や筋肉から録音する

プロトコル

1。電極の作製

1. 電極を作成するには、約2フィートの長さのエナメルコーティングさ0.001インチ径のステンレス鋼線の一部をカットするはさみを使用してください。 、ワイヤーの両端にパテの小さなボールを取り付けます半分に線を折る、とツイストペアを作成するために両端を回転させ、差動電極と呼ばれる。
2. 解明を防ぐためにワイヤーのテープは、両端。識別用の各差動電極（図1A）のためのテープの異なる色を使用して、4つの差動電極を作る。
3. 一緒に差動電極のねじれ2つ、1つの端にねじられていない2インチを残し、もう一方の端に1インチ。差動電極の残りのペア（図1B）を繰り返します。
4. 両端がねじられていないままであることを確認して、2つの差動電極の両方のセットをひねります。電極接合体をホールドアップと両端が自由なまま、4つの差動電極の接合部で家庭用シリコーン接着剤を適用する。ハングと接着剤は、少なくとも4時間（図1C）のために乾燥させます。
5. 枝を絶縁するために、木のような部分はフラット、可動、表面に電極アセンブリを定める。両端を扇形に広げるとテープで固定します。ちょうどその支店の前に電極アセンブリを昇格し、そのテープで固定するプラスチックの小片を使用してください。
6. 解剖顕微鏡で、シリコン接着剤でコートして枝をピンセットを使用してください。 1インチ長い末端は動物の内側になりますので、接着剤の非常に薄い上着が必要です。接着剤は、少なくとも3時間乾燥することができます。
7. 2センチメートル1つの差動電極の1インチ長い方の端を短くしてください。各ワイヤ上で、シリコンとエナメルの1cmを削除します。録音用フックに1つの裸線をカール。フックから他の線を上に曲げると離れて、これは、アース線として機能します。残りの3つの電極のために繰り返します。
8. 2インチの端にある4つの電極のいずれかを選択します。 2線のそれぞれに裸のステンレス鋼線の1cmを公開、シリコンをこすり、オフエナメルに鉗子を使用してください。 2本のワイヤの各々に半田ゴールドコネクタ。端を固定し、地上と録音端子との間の分離を維持するために、ラボのテープの一部を使用してください。残りの3つの電極のために繰り返します。
9. 動物の中で電極を固定するために、ケーブルにフックの端から約1.5インチのシリコン接着剤の1〜2センチメートルボールを取り付けます。少なくとも1時間（図1D）を乾かせてください。
   
   
   図1電極接合体の作製。 （A）、その両端で折り返しとツイストペア線で構成される単一の差動出力電極は、テープで固定。 （B）2つの差動電極が両端にねじられていないスペースを残して、一緒にツイスト。異なる色のテープまたは別のマーキングは、両端を識別するために使用されるべきである。 （C）すべての4つの差動電極がテープの異なる色でマークされたそれぞれの側の個別電極、の別の支店を持つ、単一のケーブルを形成する単一電極アセンブリに結合。電極アセンブリの（D）最終的なフォーム。左側には、各差動電極の録音とアース線のためのカールのフックがあります。右側には、金色のコネクタピンは、アンプに接続するための配線に半田付けされています。シリコン接着剤のアンカーボールは、アセンブリの左側に向かって配置されています。

2。移植のための動物の準備

1. 350〜450グラム重量は約健康な動物を選択してください。海藻の小さな断片に反応して、動物は5〜3の間の秒の間隔で刺されを生成する必要があります。電極の注入との完全な手術は約1時間かかります。
2. 動物を麻酔するために、30％w / vの等張MgCl ₂で、それを注入する。血リンパとMgCl ₂の損失を防ぐために、注射部位は、ニードルを取り外す前に、瞬間接着剤で被覆することができる。
   
   動物は、電極の注入、および切開の場所（バーで示される）のために固定されている方法を示す図2。模式図。
   
   
3. ダウンその足で解剖トレイに麻酔動物をレイアウト。動物の頭部を上直面して、動物が離れて傾いて、その側に部分的であることを、左のように鰓の領域をシフト。前触手（図2）を突き止める。
4. 解剖顕微鏡のステージ上にトレイを置きます。離れて切開から、頭を上げ、尾の血リンパの収集に約20度の角度でトレイを支える。
5. 解剖はさみを使用して、目玉模様の右手に少し切開を起動して1〜1.5センチメートル前方に延長する。切開開放（;切開を示す眼点の近くにノートバー図2）を保持するトレイの端に接続されているリトラクターを使用してください。
6. 頬質量を公開するには、下に透明な膜を持ち上げるために鉗子を使用して皮膚とメイン切開に一致する開口部をカットするはさみを使用してください。リトラクターへの膜の端を挟む。

3。電極注入

1. マイクロマニピュレータの電極アセンブリを配置し、動物の切開の上に移動します。
2. radular神経は、アクセスするための最も困難で、最初のアプローチされる必要があります。 radular神経にアクセスするための2つのオプションがあります。
3. 好適である最初のオプションは、、BN1とBN2の間に頬神経節の下を見ることです。 radular神経の枝が表示されている場合は、先の細いピンセットを使ってブランチ（ラベル1神経節の下に図3、RNのループ）を持ち上げるために鉤状に曲げられる。
4. radular神経の枝は筋肉上記にアクセスできない場合、二つ目のオプションは頬神経節（2と表示された筋肉の下に図3、RN）の基部にある結合組織の隣のI2の小さな切開を介してアクセスすることです。 I2の切開は、I2筋肉の二つの層を通過する必要があります。ストレートピンセットによる筋肉の切開の縁の上に持って、RNのブランチを引き出すためにフック鉗子を使用してください。
5. 有鉤ピンセットで神経を保持しながら、神経に電極のフックを操作する鉗子の異なるセットを使用してください。
6. 神経を離れて頬質量から、他の神経や組織の明確なリフトアップされるようにフックを高めるためにマイクロマニピュレーターを使用。神経の伸び過ぎてはいけません。
7. 注射器で余分な水分をオフまたは吸引ワイプ金を使って電極を乾かします。水の表面張力は、それ自体で崩壊する神経、または神経の下に形成する水のシールを引き起こす可能性があります。接着剤が適用される前に、どちらの場合でも、領域が完全に乾燥する必要があります。
8. フックのベースは、神経の底部に接触している瞬間接着剤の小さい軽打を適用します。瞬間接着剤を設定するには、 アメフラシ生理食塩水または体液のドロップを適用します。接着剤が湿っているときに何もワイヤーと神経との間の接着剤は電気的接続をブロックするような取得のように移動するべきではありません。
9. もう一度フックを乾かします。アイスパックをクイック實の接着剤を混ぜる。
10. 完全にフックの露出配線をカバーするクイック- Silの接着剤の少量を適用するためにピンの先端、ではなく、アース線を使用してください。
11. 接着剤は、それがフックのセクションから離れてくるとすれば接着剤を再調整する、約5分間に設定することができます。時（図4の最終構成を示しています）ピンに触れ、それはもはやスティック糊が設定されています。
12. radular神経電極がセットされると、I2筋肉にアクセスすることができます。 BN1とBN2の間の領域では、フックにフック鉗子を使用し、軽く上向きにバンドを引っ張って、筋肉の残りの部分からI2筋肉の2バンドを分離する。同じ手順を使用して、電極を取り付けます。
13. 頬神経2と3は簡単にアクセスされ、電極は同じ手順で接続されています。
14. 一度、すべての電極が接続され、アップシリコンアンカーへの動物に電極アセンブリをスライドさせます。
15. 切開は、動物の内部にアンカーを保ち、突起電極のケーブルの周りに閉じて縫合。良好なシール性を確保するためにステッチを瞬間接着剤。
16. 発泡スチロールの小さなブロックに電極のもう一方の端にある金色のコネクタの先端を挿入します。一晩回復のための曝気分離容器のメインタンクに動物を返します。

図3。頬質量として知られているアメフラシ供給装置の図。頬神経（BN1、BN2、BN3）、終了する頬神経節の下部には、その後、筋肉の下に急落することradular神経（RN）、および電極が接続されているI2筋肉上の場所が示されている。

図4。神経に接続されている（または筋肉）、所定の位置に接着された単一の電極の模式図。カールフックのデ - 絶縁領域は、瞬間接着剤で固定アンカー神経（または筋肉）、と直接接触している、と電気的にクイック- SILを用いて液体培地から絶縁することに注意してください。接地電極のdeinsulated先端が流体媒体に露出していることにも注意してください。

4。録画

1. 少なくとも1.5時間の録音機器に接続しながら通気コンテナ内の動物を順応。動物はすべての電極が機能していることと、ノイズレベルが低いことを確認するために慣れている間に信号を監視します。
2. 神経と筋肉の電極からの信号を記録するためにコンピュータを使用しながら摂食行動を記録するビデオカメラを使用してください。それは同時にAxoscopeのコンピュータ上に追加のチャネルとして記録している間、カメラビューのデジタルカウンタを制御する矩形波信号を使用してビデオと電極の録音を同期させます。
3. 摂食行動は、デ手法によって誘発されるモートンとチール1993年にスクライビング。

無脊椎動物では制度的動物の使用およびケア委員会による正式な承認を必要としないが、我々は、 アメフラシのすべての治療法が害を最小限にし、動物に苦しみ、そして動物は完全に麻酔のときにすべての手術手技が行われることを確保している。

代表的な結果

嚥下応答中の筋肉（伸筋I2）から図5（）同時4チャンネルの録音、三頬神経（radular神経、RN、頬神経2、BN2、と頬神経3、BN3）から。 （B）は、ツバメの動きは、容易に可視化できるように白いバンドで0.5 cmの間隔でマークされているプレカット海藻のストリップを（幅0.5センチ）、など、自由に振る舞う動物の同時ビデオ録画から静止フレーム動物飼料。

ディスカッション

これらの録音を成功に導いたしたキー技術革新は、一本のケーブルに電極を組み合わせています。二つの電極の記録は前に使用されますが、4つの個々の電極に拡大すると、多くの場合、通常の餌の動きを作ることから動物を防ぐ外科的癒着の形成をもたらしたされています。つのケーブルに電極を組み合わせることで順番に免疫応答を減少させる動物、内部電極の大部分を削減し、動物はより自由に移動することができます。

この手順の他の革新的な側面は、神経や筋肉に電極を添付するスーパーグルーとクイック- SILの組み合わせです。以前は、スーパー接着剤が使用されていたが、二つの接着剤の組み合わせは、確実に動作しますし、長く水にさらされた場合、約3日で分解するスーパー接着剤、より数日間続くことができます。

我々は、個々の識別されたニューロンの細胞体から記録または刺激のためにそのまま、行動を動物に細胞外電極を埋め込むことが可能であることが示されている[ワーマンとチール、1995;。Luら、2008]。我々はこのホワイトペーパーで説明している複数の電極技術は、このように同時...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エナメル被覆ステンレス鋼線	California Fine Wire Company		0.001D, coating h
家庭用シリコーンII接着剤	GE Healthcare
Kwik-Sil接着剤	World Precision Instruments, Inc.
Duro Qwik-Gel 瞬間接着剤	Henkel Corp
A-M Systems model 1700 アンプ	A-M Systems		フィルター設定：神経 100-1000Hz、I2 筋肉 10-1000Hz
Axoscope 10.1	Molecular Devices
金メッキコネクタピン	Bulgin	SA3148/1
金メッキコネクタソケット	Bulgin	SA3149/1