アフリカツメガエルの胚および細胞接着アッセイのアセンブリから主催し、動物極の外植片の解剖

サマリー

自分の眉製の特殊な解剖ツール - このビデオでは、眉毛のナイフの使用を含むアフリカツメガエルの胚から主催者と動物極の外植片、の調製に用いられる技法を示しています。接着アッセイを組み立てるためのプロトコルも与え、その適切な開発のための重要な面の主催者や動物極細胞上に存在する主要な接着分子の存在のためのプローブです。

プロトコル

準備接着チェンバース（注入/解剖前日）

接着アッセイチャンバー

あなたが従来の複合顕微鏡を（ステージ上の光学位置）がある場合、それは低身長の付着室は、次のようにするためncecessaryです。倒立光学顕微鏡を使用している場合は、"NUNCのLab - Tek社チェンカバーガラスは、"単に使用され、ステップ＃1へスキップする - 2。

1. 40 × 24ミリメートルのカバースリップ上で"、ボタンを押してシールシリコン絶縁体"のいずれかを取り付けます。しっかりときれいなベンチトップでカバースリップに絶縁体を押すと、絶縁体は完全に任意の気泡なしで接続されていることを確認するために他の側から見て。
   
   
2. オプション：滅菌するために、乾燥サイクルのワットマン濾紙とオートクレーブのガラスシャーレに付着室を置く。 RTにそれらをクールダウン。

コー​​ティングチャンバー

1. sigmacoated黄色のヒントを使用して、オートクレーブ接着室の中央にカドヘリン（10mg/ml）またはフィブロネクチン（20mg/ml）のワーキング溶液200ミリリットル液滴を置く。 4時間室温でインキュベートする。
   
   
2. カドヘリンまたはフィブロネクチンのソリューションを取り出し、1.5mlチューブに移す。このソリューションは、次の2週間のために再利用することができます。
   
   
3. チャンバーをブロックする1X MBS - Hの4％のBSAの500ミリリットル分注する。 1時間室温でインキュベートする。
   
   
4. BSA溶液を吸引除去する。 1X MBS - H倍の500ミリリットルでチャンバーを洗浄する。回目の洗浄後は、（完全ではない）MBS - Hのほとんどを吸引除去し、4℃で密閉容器に保管3日 - この付着室は、次の2のための良いです。

アニマルキャップの外植片の解離と解離

1. 非オートクレーブ培地はいつか解離アニマルキャップ細胞を乱すことができる小さな細菌を運ぶように、オートクレーブ1X MBS - Hから希釈した0.1 × MBS - Hの注​​入胚を、インキュベートする。
   
   
2. あなたのサンプルの数と少なくとも同じくらい多くに60mm皿に1 ×バルトのアガロースプレートとCMF - MBSアガロースプレートを作る。 1Xバースプレートに高圧蒸気滅菌1X MBS - Hを注ぐ。 CMF - MBSプレートの場合は、CMF - MBSの10ミリリットルを注ぎます。
   
   
3. 胚のステージ8.5になると、1 ×バースのプレートで動物のキャップを解剖開始。 10 - サンプルあたり15の外植片は、実験のために通常は十分です。
   
   
4. CMF - MBSのプレートにアニマルキャップの外植片を移す。外植片が完全に解離されるまで60分 - 45の外植片をインキュベートする。 15分ごとに穏やかな扇動は、解離を助ける。

細胞接着アッセイ

1. 細胞を播種する：1X MBS - H接着アッセイチャンバーとコーティングチャンバー、上記のセクションの手順で準備した接着チャンバーへの500ミリリットル分注する。 CMF - MBSプレートからsigmacoatedとみじん切りオフ黄色のヒントをP200を使用して付着チャンバーに解離アニマルキャップ細胞を移す。
   
   
2. 省略可能：可能であれば、慎重に空気に細胞をさらすことなく、途中に約2 / 3に培地を吸い取る。培地は、十分なのCa ^{2 +}およびMg ^{2 +が}含まれ^ていること^を確認するために、約新鮮なMBS - Hの同量を追加。
   
   
3. 90分 - 45のために室温でインキュベートする。彼らは底面に接続しているかどうかを確認するために時々セルを確認してください。
   
   
4. これで、顕微鏡下で細胞の写真を撮ることができる。
   
   
5. グリッドスライドガラス上に接着室を置く。グリッドのスライドの隅に付着室の隅のいずれかを合わせます。いくつかの異なるグリッドに接続されたセルの数をカウントし、記録する。
   
   
6. 大きなプラスチックのバケツ（例えば、タッパーウェアなど）にMBS - Hの1Lを注ぎます。ゆっくりとバケツの底に付着スライド室を置く。低速で5分間オービタルシェーカー上でそれを回転させる（50 - 60rpm）。
   
   
7. このセクション、細胞接着アッセイのステップ＃5で行ったように、グリッドのスライドの同じコーナーにチャンバーの同じコーナーを合わせ、グリッドのスライドに戻って接着室を置く。あなたが洗浄前にカウントされていることを同じグリッドに接続されたままの細胞の数を数えます。洗浄後に接続されたままの細胞の割合を計算する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x MBS-H	バッファー			Modified Barth’s medium：1 L 調製法：5.14 g NaCl 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES（フリー酸）。NaOHでpHを7.4に調整する。オートクレーブ滅菌を行う。
CMF-MBS	バッファー			これはMBS-HのCa2+/Mg2+除去バージョンである。500 mL 調製法：2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES（フリー酸）。NaOHでpHを7.4に調整する。オートクレーブ滅菌を行う。
1% アガロース/1x Barth’s プレート				サンプル数と同数
1% アガロース/CMF-MBS プレート				サンプル数と同数
E-Cadherin/Fc キメラ	試薬	Sigma-Aldrich	E-2278	40% グリセロールを含む1x MBS-H 100 µLに、0.1 mgの固形E-cadherinを溶解し、100倍マスターストック（1.0 mg/mL）を作成する。–20 °Cで保存する。使用直前に1x MBS-Hで1/100に希釈し、10 µg/mLのワーキングソリューションを作成する。このワーキングソリューションを1サンプルあたり200 µL必要とする。
フィブロネクチン 0.1% 溶液	試薬	Sigma-Aldrich	F-1141	この既調製溶液を50倍ストックとして使用できる。使用直前に1x MBS-Hで1/50に希釈し、20 μg/mLのワーキングソリューションを作成する。このワーキングソリューションを1サンプルあたり200 μL必要とする。固形フィブロネクチンの使用は、0.1%の濃度でストック溶液を作成する際に溶解が困難であるため推奨しない。高価ではあるが、一貫した結果を得るにはこの既調製0.1%溶液の方が適している。
4% BSA /MBS-H	バッファー			BSA：分子生物学グレード 分画V
Sigmacoted イエローチップ	ツール
No.1 カバーグラス				40 mm x 24 mm または 60 mm x 24 mm
プレスシールシリコンインシュレーター	ツール	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	深さ 2.5 mm x 直径 20 mm
NUNC Lab-Tek チェンバードカバーグラス	ツール	Fisher Scientific	12-565-471	2ウェル/スライド
グリッドスライドガラス	ツール			または細胞計数用ファインダーグラティキュール