MSH2 - MSH6 DNAの複製エラーの修復を開始するのに責任があります。ここでは、この重要なタンパク質がどのように動作するか理解に向かって遷移速度論のアプローチを提示する。報告書は、結合DNAの結合とDNA修復のアクションのMSH2、MSH6メカニズムの基礎となるATPアーゼの動態を測定するためのストップトフロー実験を示しています。
方法論記事
MSH2 - MSH6 DNAの複製エラーの修復を開始するのに責任があります。ここでは、この重要なタンパク質がどのように動作するか理解に向かって遷移速度論のアプローチを提示する。報告書は、結合DNAの結合とDNA修復のアクションのMSH2、MSH6メカニズムの基礎となるATPアーゼの動態を測定するためのストップトフロー実験を示しています。
このアプローチは、活性部位の濃度と高分子の機能を支配する本質的な速度定数を含むメカニズムに関する情報が得られるので、一時的な動態解析は、生体高分子の働きを理解する上で不可欠である。酵素の場合には、例えば、一時的または前定常状態の測定は、反応経路の個々のイベントを同定し、定常状態の測定値は、全体的な触媒の効率と特異性をもたらすのに対し。このようなタンパク質 - タンパク質またはタンパク質 - リガンド相互作用およびレート制限立体構造変化などの個々のイベントは、多くの場合、ミリ秒のタイムスケールで発生し、ストップトフローと化学クエンチフロー法によって直接測定することができます。このような蛍光などの光信号を考えると、ストップトフローは、製品リリースと触媒回転率の1,2に結合する基質から反応の進行を監視するための強力かつアクセス可能なツールとして機能します。
ここで、我々は、MSH2、MSH6の作用のメカニズム、DNAと信号のミスマッチ修復（MMR）3-5の塩基対のミスマッチ、挿入/削除のループを認識する真核生物のDNA修復蛋白質を調べるためにストップトフロー速度論の応用を報告する。そうすることで、このようにMSH2 - MSH6増える3桁（エラーの頻度が〜10 -6〜10 -9塩基から減少）によるDNA複製の正確さ、とは、ゲノムの完全性を維持することができます。驚くことではないが、欠陥のある人間MSH2 - MSH6機能は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌と他の散発性の癌6月8日に関連付けられています。この重要なDNA代謝蛋白質の作用機序を理解するために、我々はミスマッチDNAだけでなく、MMRの燃料そのアクションをATPase活性とMSH2 - MSH6相互作用のダイナミクスをプロービングしている。 Tミスマッチとリアルタイムで2 - アミノプリンの蛍光の結果として増加を監視する：DNA結合は、急速にGに隣接する2 - アミノプリン（2 - AP）蛍光体を含むDNAとMSH2 - MSH6を混合することによって測定されます。 T（2 - AP）ラベルのないトラップのDNAと時間9以上の蛍光でモニタリングの減少とのミスマッチの複雑な：DNA解離は、予め形成MSH2 - MSH6 Gを混合することによって測定されます。前定常状態のATPアーゼの速度は、7 - ジエチルアミノ-3 - （（（（2 - maleimidyl）エチル）アミノ）カルボニル）クマリン）で標識された結合リン酸のリン酸結合タンパク質（MDCC - PBP）（の蛍光の変化によって測定されるPiは）ATPの加水分解9,10以下のMSH2 - MSH6によって解放。
T複雑な、ターン結果にATP結合型のタンパク質のATP加水分解と安定化の抑制に：長寿命MSH2 - MSH6 GのTミスマッチと形成：データはGにMSH2、MSH6の急速な結合を明らかに。反応速度は、二重らせんのミスマッチ塩基対をバインドする方法のATP -結合MSH2 - MSH6信号のDNA修復その仮説のための明確なサポートを提供しています。
F.ノアビロと潔宅が平等にこの論文に貢献した。
MSH2 - MSH6 DNA結合速度のA.測定
1。 MSH2 - MSH6 DNA結合反応速度の実験用サンプルの準備
ストップトフローの蛍光ベースの運動DNA結合実験用試薬の調製は、蛍光光度計での平衡の実験の場合と同様です。確かに平衡結合分析は、運動解析のために反応条件を最適化するために、相互作用の解離定数（K D）を推定するために最初に実行されるべきである。ストップトフロー実験では平衡または定常状態の実験と比較して生物学的物質のより大きな量を必要とする、蛋白質の低ミリグラム量は11,12およびリガンドの同様の量の利用可能な場合、そのため、アプローチが最も実現可能であるが調製または購入することができます。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ここに記載されたDNAのミスマッチ結合タンパク質の例は、生体分子のメカニズムを研究するための一時的な運動方法のパワーと実用性を示しています。シングルターンオーバーの時間スケールでのストップトフロー測定は、ミスマッチ塩基対と反応9の長寿命のタンパク質のXのDNA複合体の形成にMSH2、MSH6タンパク質の迅速かつ特異的結合のための明白な証拠を提供した。また、ATPase活性のストップトフロー（およびクエンチフロー）分析は、結合ミスマッチDNA 11,16後にATP -結合配座への切り替えMSH2 - MSH6のための直接的な証拠を提供した。このスイッチは、DNA修復17,18を通知するために仮定されている。補完的な高分解能の構造データと一緒にこのような高解像度の運動データは、高分子の機能の理解を進めるために不可欠です。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
この作業は、NSFのキャリア賞（MMH）、バリーM.ゴールドウォーター奨学金（FNB）とASBMB学部研究賞（CWD）によってサポートされていました。 PBPの過剰発現用クローンは、親切にドクターマーティンウェッブ（MRC、英国）から提供された。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| DNAの名 | シーケンス |
| 37 G | 5' - ATT TCC TTC AGC AGA TAT G TA CCA TAC TGA TTC ACAのT -3' |
| 37 T（2 - AP） | 5' - ATG TGA ATC AGT ATG GTA T のAp T ATC TGC TGA AGG AAAのT -3' |
| 37 T | 5' - ATG TGA ATC AGT ATG GTA T T ATC TGC TGA AGG AAAのT -3' |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト
許可をリクエスト