出典:Sarasija, S. and Norman, K. R. Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
このビデオでは、不妊の成虫C.エレガンスの発達同期集団を生成する方法を示します。このプロトコル例では、線虫を同期させて、生きた動物の酸素消費率を研究します。
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方法論記事
線虫の同期:同一の発生段階にある線虫の集団を取得する方法
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
このプロトコルは、Sarasija and Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。
1. 線虫個体数の増加と同期
これらの動物は~42時間後にL4幼虫期に到達します。このとき、L4幼虫をプラチナピックを使用して、0.5 mg/mLの5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(FUdR)を含むOP50播種NGMプレートに移し、子孫を作らないようにします
ノート実験内では、すべての菌株が同程度の時間同期していることを確認します。FUdR処理は、動物を不妊にし、OCRに影響を与える可能性のある産卵と子孫の生産を防ぎます。これらの滅菌された動物は、アッセイのために翌日 (~66 時間で成体動物 1 日目) に分析されます。FUdRは、特定の変異型線虫の生理機能と寿命に影響を与えることが報告されています。したがって、薬を滅菌に使用する場合は、これを考慮に入れる必要があります。線虫は、fem-1(hc17)やfem-3(e2006)などの女性化変異によっても滅菌できます。しかし、これらの変異はミトコンドリアの機能に影響を与える可能性があります。
- 所望の遺伝的背景(例えば、N2[野生型]およびsel-12動物)のL4幼虫を、大腸菌(OP50)の芝生で播種したばかりの線虫増殖培地(NGM)プレート(レシピは表1を参照)に移します。各ひずみに少なくとも2つの100 mmプレートまたは3つの60 mmプレートを使用してください。適切な増殖温度(15〜25°C)で3〜4日間、またはプレートが多数の卵と妊娠した寄生虫で濃縮されるまで、ワームをインキュベートします。
- 線虫100 mmプレートあたり約6 mLのM9バッファー(レシピについては表1を参照)を使用してプレートから卵と線虫を洗い流し、ガラスパスツールピペットで各株の個別の15 mL遠心チューブに移します。これらのチューブを6,180 x gで3分間回転させ、M9バッファーを吸引して、動物と卵のペレットのみを保持します。
- 各チューブに3〜4 mLの漂白剤溶液(レシピは表1を参照)を加え、6分間断続的にボルテックスします。M9バッファーを加えて各チューブを満たし、6,180 x gで1分間遠心し、上清を吸引します。この洗浄をM9で3回繰り返し、卵ペレットを約9 mLのM9バッファーが入った新鮮な15 mLチューブに移します。
- 孵化したばかりのワームを20°Cで16〜48時間刻み、これらのチューブを6,180 x gで1.5分間回転させ、同期したL1動物をOP50の芝生(100 mmプレートあたり約6,000〜10,000匹)で播種したばかりの個々のNGMプレートに置き、20°Cに保ちます。
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結果
>表1:NGMプレート、M9バッファー、漂白剤溶液のレシピ。
の| M9バッファー(1 L) | |||
| dH2O(ディH2O) | 1,000ミリリットル | ||
| NaCl | 5グラム | ||
| KH2PO4 | 3グラム | ||
| Na2HPO4 | 6グラム |
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100 mm; 60 mm シャーレ | Kord-Valmark実験器具製品 | 2900; 2901 | |
| 15 mLコニカルチューブ | コーニング | 430791 | |
| 50 mLコニカルチューブ | コーニング | 430829 | |
| 寒天 | フィッシャーサイエンティフィック | BP1423-2 | |
| バクトペプトン | BDです。バクト | 211677 | |
| バクトトリプトン | BDです。バクト | 211705 | |
| バクト酵母エキス | BDです。バクト | 212705 | |
| 漂白剤 | ジェネリック | ||
| 塩化カルシウム二水和物(CaCl2・2H2O) | フィッシャーサイエンティフィック | C79-500 | |
| コレステロール | フィッシャーサイエンティフィック | C314-500 | |
| 脱イオン水(dH2O) | |||
| ガラスパスツールピペット | クラッケラー・サイエンティフィック | 6-72050-900 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4・7H2O) | フィッシャーサイエンティフィック | BP213-1 | |
| リン酸二塩基性カリウム(K2HPO4) | フィッシャーサイエンティフィック | BP363-1 | |
| リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4) | フィッシャーサイエンティフィック | P285-500 | |
| 塩化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP358-10 | |
| 水酸化ナトリウム(NaOH) | フィッシャーサイエンティフィック | BP359-500 | |
| リン酸ナトリウム二塩基性無水物(Na2HPO4) | フィッシャーサイエンティフィック | BP332-1 |
