細胞株からのスフェロイド作製:三次元(3D)細胞培養法

>1. 大腸がん細胞株からのスフェロイドの生成

1. HCT 116(分化クラスター19(CD19)および緑色蛍光タンパク質(GFP))を安定して形質導入した細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水(PBS;25 cm²の場合は5 mL、75 cm²フラスコの場合は10 mL)で洗浄します。トリプシン(25 cm²フラスコの場合は0.5 mL、75 cm²フラスコの場合は1 mL)を添加し、細胞を37°Cで5分間インキュベー
トします。
2. 顕微鏡で細胞の剥離を確認し、完全なロズウェルパークメモリアルインスティテュート160培地(RPMI 1640)(RPMI 1640 + 10% FCS + ゲンタマイシン、25 cm²フラスコの場合は10 mL、75 cm²フラスコの場合は20 mL)で細胞解離酵素を中和します。
3. 細胞懸濁液を500 x gで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を除去し、5 mLの完全RPM1 1640培地で数回上下にピペッティングして再懸濁します。
4. 互換性のあるセルカウンターでトリパンブルーエクスクルージョンを使用してセルをカウントします。
5. 細胞懸濁液を500 x gで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を除去し、RPMI培地に再懸濁して5 x 10³細胞/mLを得ます。
6. 96ウェルの丸底プレートに、PBS中の100 μg/mLのポリ-L-リジン(PLL)を100 μL/ウェルで室温で1時間コーティングします。PBSで2回洗い、プレートを乾かします。
7. 細胞懸濁液を滅菌リザーバーに移し、マルチチャンネルピペットを使用してPLLコーティングされた96ウェル丸底プレートに200 μL/ウェルを分注します。
8. プレートをインキュベーター内の自動イメージング装置(37°C、5%CO₂、95%湿度)に移します。
9. 取得ソフトウェアにログインし、[Schedule To Acquire] | [Launch Add Vessel] | [Scan On Schedule] | [Create Vessel: New] を選択します。
10. [スキャンの種類] : [回転楕円体] を選択します。目的のチャンネルを選択します:Phase + Brightfield(スフェロイドの成長を追跡)、Green(腫瘍シグナルを追跡、取得時間300 ms)、およびRed(アポトーシスを追跡、取得時間400 ms)。
    1. 希望の倍率(10倍)を選択します。
    2. プレートモデルと引き出し内の位置を選択します。画像化するウェルの位置を選択します。実験の説明を入力します:名前、セルの種類、セルの数。
11. 解析設定には、[解析を後で延期]を選択します。タイムラインを右クリックして[選択したスキャングループ間隔の設定]オプションを選択し、[スキャンの追加間隔]を4時間に設定し、[合計]を24時間に設定します。希望の開始時間を設定します(自動イメージング装置でのインキュベーション後少なくとも1時間)。
12. イメージングソフトウェアにログインして、スフェロイドの成長を2日ごとに確認してください。
    1. 「View Recent Scans」オプションを選択し、目的の実験をダブルクリックします。画像チャンネルパネルで明視野を選択し、画像特徴の測定ツールを使用して回転楕円体の直径を測定します。回転楕円体が目的のサイズ(直径0.5mm)に達するまで6日かかります。4日目にウェルあたり50 μLの完全RPMI培地を添加して、培地の蒸発効果を制限します。