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Abstract

出典:Koemans, T. S., et al. 学習と記憶の尺度としてのショウジョウバエの求愛条件付け。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、求愛条件付けと呼ばれるショウジョウバエの学習と記憶をテストする古典的な条件付けアッセイについて説明しています。このアッセイは、非受容的な事前結合された女性による拒絶を経験した後の男性の求愛の減少に基づいています。このプロトコル例は、短期記憶と長期記憶の評価に使用できる手順のセットアップを示しています。

Protocol

このプロトコルは、Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

注:以下に概説するプロトコルでは、収集、トレーニング、およびテストの1つの複製が説明されています。結果の再現性をテストするには、これらのステップを並行して、複数の日に、別々のハエのグループで繰り返す必要があります(表1)。このプロトコルは、卵から成虫までの10日間のライフサイクルに基づいており、これは、25°C、湿度70%、および12時間の明暗サイクルの一定の条件下でハエを飼育する場合には正常です。このプロトコルのすべての側面は、アッセイ全体を通じて条件が一定に保たれていることを前提としています。インキュベーター内の照明が点灯する時間前(BLO)または照明が点灯した後(ALO)の時間は、研究者の好みの時間に応じて便利に設定できるため、時間として示されます。CO2ガスは、ナイーブなオスのハエの最初の収集と、事前に交配したメスの収集にのみ使用してください。この求愛条件付けのプロトコルは、次の手順で構成されています。

1. プレメイトされた女性のコレクション文化の確立
2. 男性被験者の収集のための文化の確立
3. ハウジングブロックの準備
4. 標準化された嵌合済み雌の生産のための嵌合バイアルの確立
5. 男性被験者の集大成
6. 訓練
7. テスティング
8. ビデオデータの解析と統計

1. プレメイト・フィメール・コレクション・カルチャーの確立

1. パワーフードを準備します。0.8%(w / v)寒天、8%(w / v)酵母、2%(w / v)酵母抽出物、2%(w / v)ペプトン、3%(w / v)スクロース、6%(w / v)グルコース、0.05%(w / v)MgSO₄、および0.05%(w / v)CaCl₂を水で15分間煮沸します。溶液を70°Cまで冷ましてから、0.05%(w / v)メチルパラベン(注意:有毒)と0.5%(v / v)プロピオン酸(注意:有毒)を添加します。さらに50°Cまで冷却しながら攪拌しながらよく混合し、均質な溶液を得る。
2. 食品が室温で固まる前に、175 mL のプラスチックバイアルごとに ~50 mL のパワーフードを加えます。食品をさらに冷まします。バイアルをプラグで閉じます.
   注:パワーフードは、おそらく産卵を誘発することにより、大量のハエの生産のために特別に配合された特殊な食品混合物です。パワーフードは、行動分析(ステップ2)に使用されるオスのハエの生産には使用されません。なぜなら、非定型の食事と潜在的な混雑が発達に影響を与える可能性があるためです。
3. -11日目(表1)に、パワーフードバイアルに約60〜100匹のハエ(雄と雌の混合物)を入れて5〜20の野生型培養を開始する;これらはステップ4で標準化された交配済み雌を生産するために使用される。各バイアルに濾紙を追加して、幼虫が蛹になることができる領域を増やします。これにより、近づくことができるハエの数が増えます。
4. 実験全体を通してステップ1.1〜1.3を定期的に繰り返し、「標準化された交配雌の生産のための交配バイアルの確立」(ステップ4)のための入力として十分な新たに閉鎖するハエを取得します。

2. 男性被験者の集合文化の確立

1. ステップ1.1および1.2で説明したように、0.5%(w / v)寒天、2.75%(w / v)酵母、5.2%(w / v)コーンフラワー、11%(w / v)砂糖、0.05%(w / v)メチルパラベン、および0.5%(v / v)プロピオン酸を水に溶かして作られた通常の食品を準備します。175 mLプラスチックバイアルをフライバイアルプラグで閉じます。.
2. -10日目(表1)に、通常の食品が入った各175mLバイアルに、約10〜20匹のオスと約30〜75匹の処女メス(材料/機器表)を入れます。.濾紙を追加して、蛹化の表面積を増やし、生産性を最大化します。
3. 遺伝子型ごとに3〜6本の175 mLバイアルを確立して、必要な数の被験者の男性を取得します。
   注:所望の遺伝子型の生産性によっては、より多くのバイアルが必要となる場合があります。

3. 住宅ブロックの準備 (図 2A)

1. ハウジングブロックあたり約50mLのパワーフードを電子レンジで溶かすか、新鮮に調理します。
2. マルチディスペンサーピペットを使用して、96ウェル平底ブロックの各ウェルに500 μLのパワーフードを加えます。
3. 食品が室温で固まるのを待ちます。
4. ブロックをPCR粘着フィルムで覆い、針を使用してウェルごとに少なくとも4つの穴を開け、ハエに新鮮な空気を供給します。
5. 各ウェルを開くことができるようにするには、かみそりの刃を使用して、各列の間の粘着フィルムを縦に切断します。ブロックの一方の端にフィルムをそのまま残しておきます。
6. ブロックは4°Cで最大2日間保存できます.
   注:使用する前に、ブロックを室温に再平衡化させます。

4. 標準化された交配雌の生産のための交配バイアルの確立

1. -1日目に、2〜5時間のBLOで予め交配された雌の収集培養物からすべての成虫の野生型ハエを取り除き、廃棄します。
2. 吸引器(図2B)を使用して、これらのバイアルから2時間から3時間間隔(例:30分、2.5時間、および5時間のALO)でハエを収集し、少量の酵母ペーストと濾紙を補充した新しいパワーフードバイアルに入れます。
3. 混雑を避け、最適な交配雰囲気を促進するために、新しいバイアルごとに150〜200匹を超えるフライを移さないでください。少なくとも25%の男性を提供することにより、すべての女性の交配を確保します。実験のサイズに対応するのに十分なメスが交配バイアルに存在することを確認してください.
   注:これはプロトコルの重要なステップであるため、閉じたばかりのハエのみを使用し、古いハエ、幼虫、または蛹が新しい交配バイアルに移されないことを確認してください。
4. これらの「交配バイアル」を4日間インキュベートして、すべての雌が交配するのに十分な時間を確保します。

5. 男性被験者の集合

体

1. 1日目(表1)の2〜3時間のBLOで、CO₂を使用して雄の収集バイアルからすべての成虫のハエを取り除きます(ステップ2)が、次の数時間でさらに多くのハエを閉じます。
2. 次の5〜6時間で、_CO2を使用して20〜30分ごとに新たに閉じたハエを取り除き、吸引器を使用して各オスをハウジングブロックの個々のウェルに入れます（ステップ3（図2B）)。
3. 接着性PCRフィルムでウェルを再シールします.
   注:これは、プロトコルの重要なステップです。オスは頻繁に収集する必要があります。収集されたオスは、脱皮の時期に近いハウジングブロックに隔離されるべきであり、そこでは、彼らが淡い色素沈着と半透明の腹部に胎便の存在を示しています.
   注:吸引器を穏やかに使用すると、ハエの移動が可能になります。ただし、不適切な使用はハエにストレスを与え、アッセイにばらつきを引き起こします(ディスカッションを参照)。
4. 遺伝子型ごとに最大48人の男性を集めることを目指します。これにより、ナイーブな状態と訓練された状態の両方の分析に必要なオスの最大数がわずかに過剰になり、後の転送ステップでいくらかの損失が許容されます。

6. トレーニング

1. CO₂を使用して交配バイアルからハエを取り出し(ステップ4.2)、交配した雌を雄から分離します。
2. 吸引器を使用して、麻酔をかけたプレメイトされた女性を、新しいハウジングブロックの1列の各ウェルに追加します。
3. 吸引器を使用して麻酔なしで、ステップ5.2で設定したハウジングブロックから、予め交配された女性を含む井戸に個々のナイーブな男性を移します。オスをウェルに入れた後、すぐに接着フィルムで再シールします。オスを逃がさないでください.
   注:オスのハエを吸引器から住宅ブロックに移すには、自然な「ネガティブジオタクシス」行動を利用します。
4. 十分なオスとメスのペアが確立されるまで、手順6.2〜6.3を繰り返します。理想的には、遺伝子型ごとに24ペア、ハウジングブロックの2列を確立します。残りの素朴な男性は、ステップ5.2で設定した元の住宅ブロックに残しておきます。
5. トレーニング期間中、オスとメスのペアを邪魔しないままにします (表 2, 図 1B).
   注:この間、男性は求愛し、事前に交尾した女性に拒否されます。学習とSTMの場合、トレーニング期間は1時間、LTMの場合、トレーニング期間は7〜9時間です。
6. トレーニング (表 2, 図 1B) を使用して、オスを事前に準備されたメスから優しく分離し、麻酔を使用しないでください。分離した男性を新しい住宅ブロックに置きます。
7. 吸引器を使用して、すべての素朴な男性を、ステップ5.2で設定したハウジングブロックから新しいハウジングブロックに麻酔なしで優しく移します。
   注:この手順は、STMと学習ではオプションですが、LTMをテストするためにハエがさらに24時間収容されるため、LTMにとっては非常に重要です。
8. STMおよびLTMの場合、テスト(ステップ7)の前に、オスをそれぞれ1時間および~24時間休ませます(表2、図1B)。
9. 学習のために、訓練を受けた素朴な男性をすぐにテストします(ステップ7)。

7. テスト

1. CO₂を使用して交配バイアルからハエを採取し(ステップ4.2)、予め交配した雌を雄から分離します。
2. 女性を通常の食物が入ったバイアルで少なくとも1時間麻酔から回復させます。
3. テスト開始前にすべての機器を準備するために、事前にビデオレコーダーを取り付けてください (図 2C)。
4. 学習、STM、およびLTMの異なるタイムラインに従ってテストを開始します(表2、図1B)。学習のトレーニングの直後、STMのトレーニングの1時間後、LTMのトレーニングの24時間後にテストを実行します。
5. 吸引器を使用して、個々のオスを休息住宅ブロックから、または学習がテストされている場合はトレーニング住宅ブロックから(ステップ6.7、訓練済み、ステップ6.8、ナイーブ)、仕切りを閉じた求愛アリーナの半分に静かに移します(図2D;建築計画についてはファイルS1を参照してください)
   注:自然な「ネガティブジオタクシス」動作の使用は、オスのハエを吸引器から求愛アリーナに移すのに十分であるべきです。
6. エントリーホールを次のアリーナにすばやく、しかし静かに動かし、18のアリーナすべてに1人の男性が含まれるまで手順7.5を繰り返します。
7. 吸引器を使用し、CO₂を使用せずに、1つの事前交配された女性(ステップ7.2で収集)を18アリーナすべての残りの半分に追加します。
8. 井戸の開口部を下に向けて、求愛室をカメラの下に慎重に配置します(図2C)。
9. アリーナの仕切りを取り外して、オスとプレメイトメスが直接相互作用できるようにします。
10. すぐに少なくとも10分間動作の記録を開始します.
    注:2台のカメラ設定を使用する場合、2つの求愛プレートの並行記録をオーバーラップする時間枠で行い、効率を最大化できます。
11. 携帯型掃除機を使用して求愛アリーナを空にし、求愛室を換気してから再利用します。
12. すべての遺伝子型と条件(すなわち、ナイーブで訓練済み)のテストが完了するまで、ステップ7.4〜7.11を繰り返します。

8. ビデオデータの解析と統計

1. テスト期間の最初の 10 分間にオスが求愛する時間の割合として定義される求愛指数 (CI) を、個々のオスのフライごとに計算します。
   注:これは、ステレオタイプな求愛行動を観察することによって手動で行うか (図 1A) または、求愛行動の自動定量化のためのコンピュータソフトウェアを使用することによって行うことができます。
   注:十分な統計的検出力を達成し、CIデータの一貫性を判断するために、3日間にわたって状態ごとに40〜60人の男性を分析することをお勧めします。
2. 学習指数 (LI) を計算し、学習した男性の平均 CI がナイーブな男性と比較した場合の平均 CI の減少率として定義されます (LI = (CI_ナイーブ –_{CI トレーニング済み}) / CI_ナイーブ)。各テスト日の LI を評価し、すべてのテスト日を合わせて計算された累積 LI と比較します。
3. 「Genotype」と「CI」をヘッダーとして、2列のタブデータファイルを分けて作成します。
   注:これらの見出しでは、大文字と小文字が区別されます。各CIの遺伝子型の名前は、遺伝子型の説明とそれに続くアンダースコアとトレーニング条件(例:genotype_Nやgenotype_LTMなど、N = ナイーブ、LTM = 長期記憶など、Supplemental File S2 の例を参照)で構成する必要があります。このアノテーションは、analearn関数が「Genotype」列の最初のアンダースコアの後に存在する文字に基づいて、訓練されたハエとナイーブなハエを識別するため、不可欠です。
4. analearn Rスクリプト(補足ファイルS3)を使用して、ランダム化テストを実行し、異なる遺伝子型からのLI値間の差の統計的有意性を判断します。
   1. スクリプト (補足ファイル S3) を R に読み込み、”analearn” という関数を定義します。
      注:関数の定義は、analearn <- function(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE) です。
   2. Rコマンドラインに「analearn()」と入力し、ポップアップウィンドウから分析するデータファイル(手順8.3で生成)を選択して、機能を開始します。
   3. コントロール遺伝子型である参照変異を選択するには、対応する番号を入力してEnter.
      注:参照遺伝子型を選択した後、スクリプトは 10,000 回のブートストラップ反復を実行するのに数秒かかります。
   4. 遺伝子型、学習条件(すなわち、学習、STM、またはLTM)、平均CIナイーブ、平均CI訓練、LI、実験条件と比較した対照のLIとの差(LI dif)、LIの95%信頼区間の下限(LL)および上限(UL)を含む出力表(表3)を観察します。 有意差がない確率を示すp値
      注:analearnは、データファイルが配置されているディレクトリに出力テキストファイルを保存します。ただし、出力テーブルは R-Studio コンソールにも表示されます。デフォルト名は、指定されたデータ・ファイルの名前に基づいて作成されます。
   5. analearn 関数には、ブートストラップのパラメーターを調整するために関数のデフォルト設定を変更するために使用できるいくつかの引数があります
      注: “nboot” はブートストラップのレプリケート数を定義し、デフォルトでは 10,000 に設定されています。この値は、0 より大きい任意の整数に変更できます。表 5 には、関数のデフォルト設定を変更するために使用できるいくつかの引数がリストされています。ただし、ブートストラップのレプリケート数が少ないデータを使用することはお勧めしません。

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–