ショウジョウバエ穴を掘るおよびトンネリングの試金術:ハエの幼虫のティッシュ低酸素率を評価する方法

要約

出典:Qiang, K. M., et al. Drosophila melanogaster Larvaeの低酸素症を検出するための穴掘り/トンネリングアッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の穴を掘る能力とトンネル能力を評価することにより、低酸素症をテストする方法を示しています。この技術を使用すると、研究者は酸素欠乏を経験している幼虫と発達障害のある幼虫を区別することができます。このプロトコル例は、このアッセイのセットアップを示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018)からの抜粋です。

1. 幼虫の準備

1. アッセイ開始の2日以上前に、WieschausとNusslein-Volhardが説明したように、50 mLのポリプロピレンビーカーとブドウ寒天を含み、使用直前に酵母ペーストを塗った6.0 cmの使い捨てシャーレを使用して、卵産皿に所望の実験および対照の組み合わせ(それぞれ最低20匹の女性と10人の男性)の交配を設定します。ハエは、必要になるまで室温の暗闇で卵を産卵皿に入れてください。
2. ブドウ寒天レシピ – 100 mL の冷凍 100% グレープ ジュース濃縮物、350 mL の脱イオン化水、5 mL の氷酢酸、13 g の D. melanogaster 寒天を 1L のガラス ビーカーに混ぜ合わせます。寒天がすべて溶解するまで、バースト間で攪拌しながら、1〜2分バーストで電子レンジを加熱します。溶液を数分間冷却し、95%エタノールに10mLのニパジェン(メチル-p-ヒドロキシ安息香酸)の10mLを加えます。.混合し、次にプレートあたり7mLを使い捨ての6.0cmシャーレにピペットで移し、ゲル化して室温で3〜4時間乾燥させます。ビニール袋に入れて4°Cで保管してください。
3. イーストペーストレシピ– 7 gの乾燥酵母、10 mLの脱イオン水、均一な粘稠度になるまでへらで混ぜます。
4. 実験および制御幼虫を生成するための時限卵コレクション。新しいイースト菌をまぶしたブドウプレートを使用して、朝の時間帯に暗闇の中で室温で4時間卵を集めます。これらの4時間コレクションプレートを取り外し、新しいプレートと交換します。4時間の収集プレートを25°Cで一晩インキュベートし、ほとんどの幼虫が孵化する翌日の午後までインキュベートします。これらの最初の幼虫を収集し、それらを使用して実験を設定します。

2. アッセイプレートの設定

1. アッセイプレートの調製。アッセイの 1 回の実行では、10 匹の実験幼虫のアッセイプレートと 10 匹の対照幼虫のプレート 5 枚ずつを調製します。1.5 cmのコルク穴あけ器を使用して、各プレートから寒天の中央コアを取り除き、食品用の穴を開けます。イーストペースト(0.8〜0.9g)を穴に入れ、へらで軽くたたいて穴を埋めるマウンドを作ります。
2. 寒天プレートの準備 - 700 mLの脱イオン水と16 gのD. melanogaster寒天を2Lガラスビーカーに入れ、電子レンジで5分間組み合わせます。17.5 mLの10%(w / v)ニパジェンを95%エタノールに加え、混合し、30秒バーストでマイクロ波加熱を続け、続いて攪拌し、すべての寒天が完全に溶解するまで。1〜2分間冷ましてから、15mLのアリコートを10cmのプラスチックシャーレにピペットで入れます。寒天をゲル化させ、プレートを蓋で覆い、室温で数時間または一晩乾燥させます。プレートは密封されたビニール袋に入れて18°C.
   で保管します 注1:過剰な乾燥によるプレート表面のニパジェン結晶の形成を避けるため、調製後数日以内にプレートを使用してください。必要に応じて、結晶に数マイクロリットルの95%アルコールを滴下することで結晶を再溶解できます。
   注2:寒天のバッチは、異なるゲル化特性を持つことができます。ドライジェルプレートは、手触りがしっかりしていて、コルクボーラーを使用してフードホールを作成するときに、清潔で無傷の寒天の円を取り除くことができるように十分に弾力性がある必要があります(上記を参照)。
3. アッセイプレートに幼虫をセットします。機械的な圧力を使用してプラスチック製のマイクロスパチュラの先端を湾曲させ、先端をイーストペーストに浸して、幼虫を拾うための「接着剤」を提供します。最初の幼虫を個別に拾い上げ、フードマウンドの近くの寒天皿に置きます。実験遺伝子型と対照遺伝子型の両方について、10匹の幼虫の少なくとも5枚の複製プレートを準備します。完了したら、各プレートに蓋をしてラベルを付け、プレートを室温(私たちのラボでは22°C)の暗いスペース(蓋面を上にして)に置きます。

3. アッセイプレートのモニタリング

1. 解剖顕微鏡で毎日プレートを検査し、食品の上または寒天表面の幼虫の数を記録します。目に見える死んだ幼虫や死にかけている幼虫に注意してください。寒天基層へのトンネルが幼虫が3番目の星に移動するときに見られる場合、および見られる場合は注意してください。蛹が形成され始める日付に注意し、蛹の異常に注意してください。すべての幼虫が死ぬか蛹になるまで、毎日の観察を続けます。
2. 曲げたからかい針で皿から蛹を慎重に取り出し、ブドウ皿に移します。必要に応じて、蛹のモニタリングを継続して、成体として何匹が閉じるかを決定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
脱水酵母
冷凍ブドウジュース濃縮物	ウェルチズ		ほとんどの大型スーパーマーケットで販売
氷酢酸	シグマ・アルドリッチ	320099
ショウジョウバエ寒天	エイペックスバイオリサーチ製品	66〜103
メチル-パラ-ヒドロキシ安息香酸	エイペックスバイオリサーチ製品	20〜658
備品
50mlポリプロピレンビーカー
6.0cm使い捨てペトリ皿	隼	08757100Bさん
10cm使い捨てプラスチックペトリ皿	E+Kサイエンティフィック	EK-24104
プラスチック製のマイクロスパチュラ	コーニングインコーポレイティッド	3012
曲がったからかい針	ナスコ	S08848MH
解剖顕微鏡			倍率10〜30倍の顕微鏡

年