ゼブラフィッシュ心電図検査(ECG):心機能を評価するための低侵襲アッセイ

要約

出典:Zhao, Y., et al. 成体ゼブラフィッシュの生体内心電図.J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、ゼブラフィッシュの心臓の電気的活動を測定するテストである心電図(ECGまたはEKG)測定を行う方法を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2019年)。

この研究のすべての実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従って行われました。この研究のすべての動物プロトコルは、UCLAの施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 麻酔導入

1. 疼痛管理のための浸漬麻酔と、ECGデータ取得中のモーションアーチファクトを避けるために魚を固定するための液浸麻酔を準備します。ほとんどの研究室では、浸漬トリカイン(3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸、MS-222)を使用しています。
   1. トリカイン0.4%原液を作るには、ネジ蓋付きの暗いガラス瓶に次のアイテムを混ぜ合わせます:400 mgのトリカイン粉末、98 mLの二重蒸留水、および2 mLの1 Mトリス(pH 9)。.必要に応じて、1 N NaOHまたは1 N HClを使用してpH 7.0に調整します。
   2. トリカインの最終浸漬溶液を作るには、ゼブラフィッシュの年齢、サイズ、代謝状態、株、疾患モデル、科学的目的、および手続き期間に適した最小濃度を決定します。
   3. トリカイン濃度反応研究を実施し、推奨濃度の 168 mg/L (または必要に応じて 0.0168%)⁹から増減して、3 分以内に麻酔のレベル 4 を達成し、心肺毒性を最小限に抑えます。例えば、この研究では、生後12-18ヶ月の野生型ABゼブラフィッシュを0.02-0.04%のトリカイン溶液に浸すと、3分以内にレベル4の麻酔が誘発されます
      注:麻酔のレベル4では、平衡と筋肉の緊張が完全に失われ、手術運動速度が低下します。
   4. 必要に応じて、麻酔薬の選択の適切性と投与経路に関する追加のガイダンスについて、施設動物管理および使用委員会(IACUC)の獣医師に相談してください。
2. 成魚のゼブラフィッシュを、IACUCが承認した最低濃度(例えば、この研究では0.02-0.04%)のトリカイン溶液を含む皿に浸し、3分以内にレベル4の麻酔を誘発します(図1)。
   1. サバイバル心電図プロトコルでは、心電図記録セッションをできるだけ短く(10分未満)にしてください。15分未満の短時間の心電図記録セッションの場合、麻酔のメンテナンスは必要ありません。
   2. 長時間にわたる心電図記録セッションでは、長時間作用型の筋肉内麻痺薬と経口灌流システムを使用して、十分な水分補給と酸素供給を提供します。

2. 心電図リードの配置

1. ゼブラフィッシュが麻酔レベル4を3秒間維持したら、一対の鈍い鉗子を使用して、腹側表面を上にして湿ったスポンジスリットに魚をすぐに移し、ECGリード電極を配置します(図2)。
2. 3つのECGリード電極を魚の筋肉組織に約1mmの深さまで静かに挿入して、心臓の主軸の左尾側-右頭蓋向きに平行な前頭面にバイポーラリードを確立します。
3. 正(赤)電極を腹側正中線の動脈球のレベル、つまり、蓋の2つの下端を結ぶ仮想線の1〜2 mm上に配置します(図2A)。
4. 負極(黒色)を尾側に、正極に対して横方向に0.5〜1.0 mm、成体のゼブラフィッシュ心室の最大頂基底長よりも長い距離に配置します(図2A)。
5. 参照(緑色)電極を肛門領域の近く、尾側に配置します.
   注:心臓の主軸は魚によって多少異なるため、R波とT波の振幅を最大化するためには、試行錯誤しながらシステマティックに小さな変更を加えるだけでリード位置を調整してください。たとえば、両方の電極ではなく、1つの電極(正または負)を一度に変更し、ランダムな方向に不規則な変更を加えるのではなく、指定された方向に徐々に変更を加えてから、別の方向に変更します。

3. 心電図記録

1. ECGデータ取得プログラムを開きます。ドロップダウンメニューから、範囲、ローパス、ハイパスの設定を選択します。例えば、この実験で使用したin vivo ECG記録システムの次の設定では、正常な成体ゼブラフィッシュに対して一貫した満足のいくS/N比が得られます:範囲「2 mV」、ローパス「120 Hz」、ハイパス「0.03 s」
。
2. [Start]を押すと、1kHzのサンプリングレートで連続的なギャップフリーECG記録が開始されます。
3. リード線の位置を最適化して信号対雑音比を最大にするには、Stopを押してECG記録を停止し、各心臓の最初の記録試行の直後にECGトレースを確認します。成体のゼブラフィッシュの心電図が正常であると診断するには、次の4つの検証基準がすべて満たされていることを確認してください(図3)。
   1. 基準 1: すべての ECG 波形 (P、QRS、T) が明確で、すぐに見えることを確認します。
   2. 基準2:P波が正であることを確認してください。
   3. 基準 3: 正味の QRS コンプレックスが正である (つまり、R 波の振幅が Q 波と S 波の振幅の合計よりも大きい) ことを確認します。
   4. 基準4:T波が正であることを確認してください。
4. 正常なECGが予想される場合は、4つの検証基準がすべて満たされるまで、必要に応じて電極の位置を変更します(最初に負極を試してください)。
5. 正常なT波が予想されるが、T波が小さすぎる場合は、T波の振幅が最大になるように電極を再配置します。
6. リード位置を最適化した後、ECG記録を再開します。ECG スイープを後から解析するために保存します。

4. 麻酔からの回復

1. ECG記録セッションの最後に、魚を傷つけないように電極を慎重に取り外します。魚をトリカインを含まない新鮮な酸素化された魚の水に移します。
2. 麻酔からの回復を促進するために、魚が定期的な鰓の動きや水泳を再開するまで、パスツールピペットで鰓に激しく水を噴出します。
3. 魚が少なくとも5秒間直立して泳ぐ能力によって示されるように、麻酔からの完全な回復(通常は1〜2分)のために魚を監視します。

結果

図1:低侵襲のin vivo ECG記録プロトコル。概略フローチャートは、in vivo ECG インテロゲーションを実施するための 4 つの重要なアクションステップを示しています: 麻酔の誘発、ECG リード電極の配置、ECG の記録、ECG 記録の分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ECGリードの配置。色分けされた29ゲージのステンレス製電極3本が、魚の筋肉組織に約1mmの深さまでしっかりと挿入されています。負極(黒)電極と正極(赤)電極の配置により、左尾側から右頭蓋側への方向に沿...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルチャーディッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	FB087571	100 mm x 20 mm
デュモン鉗子	ファインサイエンセツール	11253から20	0.1 x 0.06ミリメートル
FE136 アニマルバイオアンプ	ADインストゥルメント	FE231
アイリス鉗子	ファインサイエンセツール	11064から07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	ADインストゥルメント		ECGモジュール付きソフトウェア
アニマルバイオアンプ用針電極	ADインストゥルメント	MLA1213	29ゲージ
プラスチック製の使い捨てトランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-669*12	6インチ、1.2 mL
パワーラボ 4/35	ADインストゥルメント	4月35
トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸)	シグマ	E10521-10G	MS-222

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