ショウジョウバエ幼虫の想像上板解剖:発達中の上皮を観察する方法

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:森本K.およびTamori、Y. ショウジョウバエ想像椎間板上皮における腫瘍の誘導と診断。J. Vis. Exp.(2017年)。

ショウジョウバエの想像上の椎間板を染色するとき、椎間板が露出しているが体に付着したままの状態で大まかな解剖が行われることがよくあります。染色されたディスクは、目的のディスクを分離してマウントします。このプロトコル例は、翼の想像上の椎間板の解剖と取り付けの手順を示しています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、Morimoto and Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

1. 幼虫の解剖

さまよう第3幼虫を木の棒または鈍い鉗子で収集し、蛍光立体顕微鏡下で適切な蛍光マーカー(EGFPなど)で遺伝子型決定し、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を含む解剖皿に入れます。
2 mLのプラスチック製トランスファーピペットでピペッティングして、PBSで幼虫を洗浄します。
片方の鉗子で幼虫の中心をつまみ、もう一方の鉗子で体を半分に引き裂きます。
片方の鉗子で前半分の口フックをつまみ、もう片方の鉗子で口を体に向かって押し込むと、体が裏返しになります。
唾液腺や脂肪体などの不要な物質を鉗子で取り除きます。

2. 固定と抗体染色

幼虫の体の解剖された前半分(想像上の翼の円盤を含む)を1.5mLのプラスチックチューブに移し、1mLの固定液(PBS中の4%ホルムアルデヒド)に10分間、暗所で穏やかに回転させて固定します
注意：ホルムアルデヒドは毒性があり、発がん性があります。皮膚に触れないように保護手袋と衣服を着用してください
注:このパートでは、特に断りのない限り、すべてのステップは、特に断りのない限り、室温の暗闇でニューテーターで行われます。
Fix ソリューションを取り外して廃棄します。1 mLのPBT(0.3% Triton X-100 in PBS)で組織を1回ずつ15分間3回洗浄します。
PBTを取り出し、1 mLのPBTG(0.2%ウシ血清アルブミンおよび5%正常ヤギ血清のPBT)を添加してブロッキングし、室温で1時間または4°Cで一晩中定性化します。
PBTGを取り出し、PBTGで適切に希釈した一次抗体溶液(材料表を参照)を加え、4°Cで一晩中ニューテートします。
一次抗体溶液を取り出し、1 mL PBTで組織を15分間ずつ3回洗浄します。
PBTを取り出し、PBTG(1:400)で適切に希釈した二次抗体溶液を添加します。室温で2時間、または4°Cで一晩定置します。
二次抗体溶液を取り出し、1mLのPBTで組織を15分間ずつ2回洗浄します。
F-アクチンを染色するには、PBTを除去し、PBSで適切に希釈したファロイジン溶液(1:40)を加えます。その後、20分間定型します。ファロイジン溶液を取り出し、1mLのPBTで組織を15分間ずつ2回洗浄します。
核DNAを対比染色するには、PBTを除去し、DAPI(4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)溶液(PBS中のDAPI0.5 μg/mL)を添加します。その後、10分
を刻みます。 注意：DAPIには発がん性があります。皮膚に触れないように保護手袋と衣服を着用してください。
DAPI溶液を取り出し、1mLのPBTで組織を15分間ずつ2回洗浄します。
PBS1 mLに1回、室温で10分間すすぎます。
PBSを除去し、プレマウント培地として500 μLの100 %グリセロールを加えます。

3. 顕微鏡スライドへの取り付け

染色した組織を2 mLのプラスチック製トランスファーピペットを使用して顕微鏡スライドに置きます。
組織を鉗子付きの別の顕微鏡スライド上の封入剤の滴に移します。
片方の鉗子で解剖した組織の端を押さえ、もう一方の鉗子で脳と目の触角椎間板を引き離します
注:解剖した脳を翼の仮想円盤の近くに置くように保持します。脳は、カバースリップが翼の仮想ディスクを押しつぶすのを防ぐプラットフォームとして機能します。
翼を分離するには、仮想椎間板を分離するには、片方の鉗子で解剖した組織の端を押さえ、もう一方の鉗子で体壁をそっと引っ掻き、椎間板を引き裂きます
注:翼の想像円板を見つけるのが難しい場合は、気管を後方から前面に剥がします。翼の架空の円盤が気管にくっつきます。
想像上のディスクをカバースリップで優しく覆い、マニキュアで密封します。4°Cで保存します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前

会社

カタログ番号

試薬

リン酸緩衝生理食塩水(PBS)

和光

〒162-19321

トリトンX-100

和光

〒168-11805

ホルムアルデヒド

和光

064-00406

ウシ血清アルブミン

シグマ

A7906

通常のヤギ血清

シグマ

G6767

封入剤, Vectashield

ベクターラボラトリーズ

H-1000

ダピ

シグマ

D9542

マウスアンチDLG 4F3