このプロトコルは、Immarigeon et al., A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。
1. 解決策と材料の準備
- 次の解決策を準備します。
- 血清補充培地(SSM)を調製する:シュナイダーのショウジョウバエ培地に10%の熱不活化ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加します。
- 1xトリプシン酵素(TrypLE Express Enzymeなど)のアリコートを調製し、室温で保存します。
- パパイン[50 U/mL]のアリコートを調製します(-20°Cで保存し、1回だけ解凍します)。
- 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS、室温で保存)を調製します。
- アクセサリーグランドの物理的な解離のために、複数の炎で丸みを帯びたピペットチップを準備します。
注:アクセサリグランドの取り扱いには、未処理のプラスチックに付着する傾向があるため、保持力の低いチップを使用してください。フレームラウンドのプロセスにより、先端の開口部が小さくなり、先端のエッジが滑らかになります。これにより、ペプチダーゼ消化後の細胞膜をせん断することなく効率的に解離することができます。
- 200 μLの先端を鋭利な刃で1つ切り取り、炎にそっと通して先端を丸くします。これにより、ステップ2.7で開口部が広く、かつスムーズに取り扱いやすくなります。
- 複数の1,000 μLチップの開口部を炎の近くで1秒未満通過させることにより、開口部を狭くします。過度な溶融や目詰まりを防ぐために、先端を少し回転させます。作られた先端を狭いものから広いものへと並べ替えます。これは、吸引速度のタイミングを計ることで実行できます。AGの小規模サンプルを解離して、最も狭い先端の効率をテストしてみてください。
注:これらのヒントは、機械的な攪拌に不可欠です。高品質のフレームラウンドピペットチップは、細胞の生存率を維持しながら完全な解離を可能にします。そのため、これらのチップは、再利用のために手順の最後に水で完全に洗浄されます。これにより、日々の再現性のある解離が可能になります。
2. アクセサリーグランドの解剖
- 20〜25匹のオスのショウジョウバエを氷の上のガラス皿に入れます。
- SSMで1人のオスを解剖します。その生殖管を取り外し、射精管以外の他のすべての組織から副腺ペアを取り除きます.
注:放出された精子が塊を作り、解離プロセスを乱す可能性があるため、精巣を取り除きます。射精バルブを取り外すと、浮いた状態での取り扱いが難しくなります。
- 鉗子を使用して、SSMを充填したガラスプレートに常温でアクセサリーグランドを移します。手順2.2-2.3を20回繰り返して、SSM.
に20ペアのグランドのバッチを取得します
注:これらのステップは15〜20分で達成され、AGは健康に見え、腺の周りの筋肉層の蠕動運動が見えるはずです。GFPは蛍光顕微鏡を用いてモニターすることができます。
- アクセサリーグランドを1x PBSに移し、室温で1〜2分間洗浄します
注:解離を良くするためには、PBSで腺をすすぐことが不可欠です。ただし、このステップの期間は、細胞がPBSでストレスの兆候を示しているため、制限する必要があります。PBSの解離した二次細胞は急速に膨潤して死にます。
- 20 μL のパパイン [50 U/mL] を 1x トリプシン酵素 180 μL に希釈して解離溶液を得ます (スケールアップまたはスケールダウンするには、各オスに 9 μL のトリプシン酵素と 1 μL のパパインを保持します)。鉗子を使用して、アクセサリーグランドをこの溶液に移します。
- 副腺(二次細胞を含む)の先端を近位部から分離します。細い鉗子を使用して腺葉の中央をしっかりとつまみ、2番目の鉗子の鋭い先端で切断します。副腺の近位部分と射精管を切除して解離を改善し、細胞の選別時間を短縮します
注:20対の腺から遠位部を解剖するには15〜20分かかり、したがってペプチダーゼによる消化は室温で開始されます。
- すべてのグランドチップを解剖した後、ステップ1.2.1で調製した特別な200 μLピペットチップを使用して、それらを1.5 mLチューブに移します。それは腺を扱う前に広く、丸みを帯び、濡れている必要があります.
注:副腺組織をピペットで移すには、先端を常に適切な溶液(トリプシン酵素またはSSM、この目的のためにそれぞれ1本のチューブを保管してください)で事前に濡らしておく必要があります。汚染を避けるために、サンプル間のチップを慎重にすすいでください。