Island Assay:ショウジョウバエの自発運動行動を評価するためのハイスループット法

要約

出典:Eidhof, I., et al. ショウジョウバエアイランドアッセイにおける自発運動行動のハイスループット分析。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、ショウジョウバエの運動を研究するために使用される行動法であるアイランドアッセイについて説明しています。サンプルプロトコルは、半自動画像解析と互換性のあるアッセイのセットアップを特徴としています。

プロトコル

このプロトコルは、Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

1. アイランドアッセイボックスの構築

1. ポリメタクリル酸メチル(PMMA)などの丈夫な素材で作られたトレイを準備し、水の層(つまり、浴)を収容します。材料が白でないことを確認してください。
   注:寸法は 40 x 35 x 2.5 cm³ を推奨します (図 1A)。
2. PMMAなどの丈夫で透明な素材で作られたボックス(42 x 38 x 25 cm³)を準備し、ハエが実験室のスペースに逃げないように、浴槽の周りに配置します。実験者がハエでバイアルを簡単に扱い、島に落とすのに十分な大きさの穴(20 x 30 cm²)を側面に配置します(図1A)。
3. 10 x 15 x 2.5 cm³ の寸法の高架プラットフォームを準備し、防水性のある不浸透性材料(PMMAまたはプラスチック)でできています
   注:このプラットフォームは、画像分析の良好なコントラストを確保するために、均一な白い表面を持つ必要があります。サイズは必ずしも固定されているわけではありませんが、すべてのハエが最初にプラットフォームに着地し、その上を歩く機会を得るのに十分な大きさにする必要があります (図 1A)。
4. 実験/撮影セッション中のプラットフォームの位置変化を防ぐために、プラットフォームをバスに接着するか、プラットフォームボックス内にウェイトやその他の重い物体を配置して、プラットフォームを固定します。

2. ソフトウェア要件とインストール

1. 画像記録ソフトのインストール
   1. 島画像シリーズを記録するための画像記録ソフト(資料表参照)をダウンロードし、パソコンにインストールしてください><。 注:このプロトコルで説明されている画像記録ソフトウェアは、Windowsでのみサポートされています。他のユーザー向けの代替が資料の表に追加されました。

3. Island Assayで試験するハエの準備

1. 前述のように、低温または二酸化炭素(CO₂)麻酔下(1〜2日間)で、各実験条件の段階的なハエを収集します。
   1. 実験条件ごとに最低3つのサンプルバイアルを準備し、それぞれに約15匹の段階的なハエが含まれています。翼が無傷で、年齢と性別が類似しているハエのみを使用してください。
      注:ここで説明する実験では、遺伝子型w^-の15匹の雄のハエを含む5つのサンプルバイアル。Actin-Gal4/+(コントロール)およびw^-;アクチン-Gal4/GD11950(tefu RNAi)は、脱皮日に採取し、4日間熟成させ、アイランドアッセイに使用しました。RNAi、コントロール株、およびActin-gal4ドライバーは、市販の供給源から入手しました(材料表を参照)。
2. 麻酔薬の影響を避けるためにハエを回復させます(CO₂を使用する場合は少なくとも1日)前に、関心のある年齢で島のアッセイで収集したハエをテストします。

4. 実験的なセットアップ

注: 図 1B を参照してください。

1. 少量の石鹸を入れた冷水をバストレイに加え、プラットフォームを中央に配置します.
   注:石鹸は水の表面張力を減少させます。水に触れたハエは溺れてしまいます。これにより、実験セッションの進行中にボックス内を飛ぶハエの量が増えるのを防ぐことができます。
2. 透明なボックスをトレイの上に置き、ランプを使用してプラットフォームを上から照らします.
   注:プラットフォームの照明は、主に適切なビデオコントラストを確保するために必要です。これには、通常の12VのLEDライトが適しています。
3. 配置します webプラットフォームの真上(ボックスの外側)で、コンピューターに接続します。
4. 実験の前に、さまざまな実験データを保存するための新しいフォルダーをコンピューター上に作成します。
   1. 図 2 A に示されている例の構造に従って、フォルダを作成します。たとえば、実験デザインで 2 つの遺伝子型をそれぞれ 5 回の反復で試験する必要がある場合は、まず実験の日付を含むメインフォルダを作成します。メインフォルダ内に、2つのサブフォルダ(遺伝子型ごとに1つ)を作成します。遺伝子型フォルダー内に、replicate.
      ごとに 1 つずつ、5 つの新しいサブフォルダーを作成します。 注:さらに解析を進めるためには、個々の実験に対応する画像シリーズを一意の名前のフォルダに保存することが不可欠です。

5. インターフェースの「キャプチャデバイス」セクションでのビデオ設定のセットアップ

1. 画像記録ソフトウェアを開き、[キャプチャ]タブで[タイムラプス画像...]をクリックし、[キャプチャデバイス]として適切なWebカメラを選択します。
2. 島に死んだハエを置き、「ビデオ設定」ボックスをクリックしてビデオ設定を調整します。ツールバーをスクロールして、白い背景に死んだハエが黒く見えるように、明るさ、コントラスト、および色を調整します (図 2B)。調整が完了したら、「OK」をクリックします。

6. インターフェースの「タイムラプス」セクションでの録画とビデオ保存の設定設定

1. 「タイムラプス動画設定」の設定を調整して、実験の様子を.aviファイルとして保存します。「参照...」をクリックし、ムービーを保存するディレクトリを選択し、ビデオの名前を定義して、「保存」を押します。
   注:ビデオファイルはデータの定量化には使用されません。ただし、実験の全体的なアイデアを得ることは役立つ場合があります。
2. 「タイムラプス動画の設定」で設定を行います。
   1. 圧縮ボックスで、ビデオ圧縮に「Intel IYUV コード」を選択し、「0.1 秒ごとに 1 フレームを撮影」を選択し、「再生速度 (1 秒あたりの画像数)」を 10 に設定します。
   2. [Advanced...] をクリックして、実験の時系列を .bmp フレームとして保存し、[キャプチャされたフレームごとに.bmp画像を作成する] を選択します。「参照」をクリックします。「AVIムービーキャプチャ中」ウィンドウ(手順6.1で選択したもの)で同じディレクトリを選択し、「開く」をクリックして「OK」を押します。
      注:実験中、フレームは .bmp ファイル (データ分析に必要) として保存されることに注意してください。プログラムは、フレームに "A" とそれに続くフレームキャプチャシーケンスに対応する番号 (例: "A_number.bmp") という名前を付けます (図 2C)。異なる実験に属する画像は常に新しいフォルダに保存して、以前に記録された一連の画像が上書きされないようにしてください。「詳細」ボックスをクリックしたときに「参照...」でこのフォルダを選択しない限り、画像はビデオファイルと同じフォルダに自動的に保存されないことに注意してください。

7. アイランドアッセイとデータ収集

1. 画像記録ソフトウェアのタイムラプス画像インターフェースのスタートボタンを押して、記録を開始します。
2. ハエが入った実験用バイアル(ステップ3)を2〜3回軽くたたいて、ハエがバイアルの底にあることを確認します。バイアルのプラグをすばやく取り外し、激しい動きでプラットフォーム上のバイアルを軽くたたいて、すべてのハエが同時にプラットフォームに落ちるようにします(図1C)。
3. 約30秒後、「停止」ボタンを押して録音を停止します.
   注:すべてのハエがプラットフォームから消えた場合は、録音を早期に停止できます。
4. 画像記録を停止した後、プラットフォームに30秒間残っているハエを手で取り除きます。
5. 次の実験の記録に進む前に、.bmpファイルとムービーのターゲットディレクトリを変更します(セクション6を参照)。

結果

図1:アイランドアッセイの要件、実験手順、および分析を概説したフローチャート。(A)アイランドアッセイ機器。(B)アイランドアッセイの実験セットアップ。(C)アイランドアッセイ。(D)「ショウジョウバエアイランドアッセイ」マクロによるアイランドアッセイデータの処理。「Drosophila Island Assay」マクロは、1)スタックとプロジェクションの作成、2)プラットフォームの定義、3)分析の3つのサブマクロで構成されています。(E)「Island Assay Analysis」スクリプトを使用したデータの処理と統計的評価。

材料

<テーブル fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> この記事で使用された材料の一覧 名前 会社 カタログ番号 コメント 25 x 95 mm ショウジョウバエバイアル ハエのもの 32-116SB - ロジクールC525HDウェブカメラ ロジクール - USB接続のWebカメラなら何でも適しています。 ウェブカメラを保持するためのスタンド - - - ランプ - - 12 V LEDライトが適切です ドキドキパッド - - どんなマウスパッドでも機能します アイランドアッセイボックス - - 寸法40x35x2.5 cm.穴20x30 cm。 アイランドアッセイバス - - 寸法42x38x25 cm。 アイランド/プラットフォーム - - 寸法:42x38x25 cm、ユニフォーム:白。 石鹸 - - 標準的な食器用洗剤が適しています。 コンピュータ - - スクリプトは Windows と Mac の両方で実行されます 画像記録ソフト「HandiAvi®」 AZcendant® (英語) - HandyAviはWindowsとのみ互換性があり、原稿全体で説明されています
ダウンロード先: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) 画像記録ソフトウェア:WebcamCapture - - MacでHandyAviの代わりに画像記録に使用できるFiji/ImageJプラグインは、以下からダウンロードできます:
https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/
この方法を使用する場合、ユーザーはこの原稿に示されているのと同じフォルダ設定と画像記録設定を使用する必要があります
ただし、実験の複製ごとに、キャプチャされた画像スタックは、
対応する実験の複製フォルダにStack.tiffとしてエクスポートする必要があります。このデータで「Drosophila Island Assay」マクロを実行すると、「First frame identifier」設定にテキストが存在しないはずです。