このプロトコルは、Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。
1. 食事の準備
- ストックの維持と幼虫の成長のために、3%の粉末酵母、10%のスクロース、9%の調理済みコーンミール、0.4%の寒天を含むコーンミール培地を使用します。
- 水道水100mLに酵母30gを入れ、沸騰させて15分煮沸します。
- これとは別に、調理済みのコーンミール90g、砂糖100g、寒天4gを水道水900mLによく混ぜます。
- 溶液を沸騰させ、火を弱め、連続的に攪拌しながら5分間調理します。
- 5分後、ホットイースト溶液を加え、さらに15分間煮ます。
- 熱源をオフにし、溶液を約60°Cまで冷まします。
- エタノールに5mL / Lの10%メチル4-ヒドロキシ安息香酸を加え、十分に混合して10分間放置します><。
注:高濃度の殺菌剤が幼虫にとって致命的である可能性があるため、4-ヒドロキシ安息香酸メチルの量には注意してください。
- 培地をバイアル/ボトルに分注します:各フライバイアル(25 mm x 95 mm)に8 mL、各フライバイアル(22 mm x 63 mm)に3 mL、各フライボトル(250 mL)に60 mL。
- バイアルをチーズクロスで覆い、室温(RT)で24時間乾燥させてから保管します。
- 使用する寒天の量および/または冷却/乾燥時間を変更することにより、CMの実験的に正しい一貫性と水和を較正します。
注:プラグを抜いた、箱詰めされた、包装されたバイアルは、4°Cで約15日間安定しています。
- ショウジョウバエの成虫には、10%の粉末酵母、10%のスクロース、2%の寒天を含む培地を使用し、その後、成虫培地(AM)と呼ばれます。
- 粉末酵母10g、ショ糖10g、寒天2gを蒸留水100mLに混ぜます。
- この混合物を電子レンジを使用して、3分間隔で、または寒天が溶解するまで2回沸騰させます。
- 溶液が60°Cに冷えたら、エタノールに5 mL/Lの10%メチル4-ヒドロキシ安息香酸を加え、十分に混合してバイアルに分注します(バイアルあたり10 mL)。
- バイアルをチーズクロスで覆い、RTで24時間乾燥させてから保管します.
注:プラグを抜いた、箱詰めされた、包装されたバイアルは、4°Cで約15日間安定しています。
2. ショウジョウバエEDC投与
- 選択したEDCを適切な溶媒に溶解して、適切な原液を調製します。EE2(分子量296.403)の場合、100%エタノール10mLに1.48gを溶解して0.5Mストック溶液を作り、-80°Cで保存します
注意：EDCは環境汚染物質と見なされており、取り扱いには注意を払う必要があります。
- EE2ストック溶液を水(v / v)中の10%エタノールで希釈して、100 mM溶液を得ます。次に、CM食品で希釈(0.1 mM、0.5 mM、1 mM)を行い、最も低い濃度から始めて、各処理グループで同じ最終濃度の溶媒を使用します。コントロールバイアルには、同量の溶媒のみを使用してください.
注:フライフード中のエタノールの最終濃度が2%を超えないように、溶媒の最終濃度をできるだけ低く保つことをお勧めします。
- 固化する前に、選択したEDCの適切な希釈液を含む溶液をコーンミールベースの食品に加え、フードプロセッサーで十分に混合し、10 mLをバイアルに分注し、綿ガーゼで覆い、RTで16時間乾燥させてから使用します
注:この媒体は準備後すぐに使用してください。
- 成体飼育では、10%エタノール水溶液(v / v)に異なる作業用EE2溶液(それぞれ10 mM、50 mM、100 mM)を調製し、それぞれ100 μLをAMの表面に層状にして、EE2の所望の濃度(0.1 mM、0.5 mM、および1 mM)を得ます。制御には、同量の溶媒のみを使用してください.
注:あるいは、選択したEDCの適切な希釈液を含む溶液を50mLの円錐管内の少量のAMに加え、十分にボルテックスして、AMバイアルの表面に1mLを層状にします。
- バイアルを綿ガーゼで覆い、穏やかに攪拌しながらRTで12〜16時間乾燥させ、すぐに使用します
注:乾燥プロセスは周囲の湿度に依存するため、実験的に調整する必要があります。
3. ハエの飼育
- 実験室で数世代にわたって維持されているOregon Rのような堅牢な同遺伝子株を使用してください。
- 加湿された温度制御されたインキュベーターにハエを保管し、自然な12時間の光で12時間の暗い日長をCM食品を含むバイアルで25°Cで
観察します。
- 各アッセイでは、RTでバイアルを使用します。
4. ライフスパンプロトコル
8匹の- 雌と4匹の雄で20バイアルのハエをセットし、CMで25°C(各10mL)でハウスハウスします。
- 4日後、ハエを捨ててバイアルをインキュベーターに戻します.
注:これらのハエは、他の年齢同期したハエのコホートを取得するために再び開始するために使用できます。
- 9日目の午後遅くに、新たに閉じたハエをすべてバイアルから取り出し、バイアルをインキュベーターに戻します
注:数人の大人は早くも9日目から閉じ始めるべきです。これらのハエを捨てることで、最大数のシンクロナイズドフライを収集することができ、早期出現者の不用意な選択を避けることができます。
- 16〜24時間後、雌雄の成虫ハエ(生後1日)を、3つの異なるEDC濃度を添加したAM食品を含む250mLボトルの4つのグループに移し、1つは溶媒のみで補充します。必要に応じて、翌日に別のバッチを収集します。
- ハエを25°Cで2〜3日間維持して、交尾させます.
注:AM食品バイアルへの移し替え日は、成人期の最初の日に対応します。
- 2〜3日後、ハエの各コホートを性別で2つのグループに分類します 軽いCO2麻酔下で。各性別をバイアルあたり20人の密度で、各性別を5つのバイアルにランダムに細分化し、各治療ごとに性別ごとに5つの並列バイアルが3回繰り返されるまで
注:CO2への長時間の曝露による長期的な健康問題を防ぐために、ハエの小グループで作業してください。
- 前の転送までの生存ハエの数から死んだハエの数を差し引いた寿命スプレッドシートを準備し、各転送の生存者の数を自動的に取得
するようにします。
- 3日ごとに対応する食物が入った新しいバイアルに同時にハエを移し、死亡を確認します.
注:移植は、ハエの寿命に長期的な悪影響を与える可能性のある麻酔なしで行う必要があります。
- 転送のたびに、ハエの年齢と死んだハエの数を記録します.
注:生き残ったハエの数はスプレッドシートで自動的に計算されますが、視覚的に確認することをお勧めします。転送中に誤って逃げたり死んだりするハエは考慮しないでください。スプレッドシートでこのメモを報告している新しいバイアルに運ばれた死んだハエを2回数えないように注意してください。
- すべてのハエが死ぬまで、手順4.8と4.8.1を繰り返します。
- 各治療グループについて、図 1 に示すように生存曲線を作成し、任意の時点でのハエの生存確率を表示します。
- ハエの各処理グループに対して、各実験で新たに閉じたハエ100匹を使用して、3つの独立した実験を行います。
- 平均寿命(各グループのすべてのハエの平均生存日数)、半死時間(死亡率が50%に達するのに必要な日数)、および最大寿命(死亡率が90%に達するのに必要な最大日数)を報告する表を準備します。
- 対照群に対する各治療群間の差をパーセンテージで計算します。
- 統計分析を実行して、さまざまな治療グループを比較します。
