ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の定量化:シナプスの形態と機能を評価する方法

このプロトコルは、Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

1. 画像処理前の要件

1. 前述のように、3番目のインスター放浪幼虫(L3)のショウジョウバエオープンブックの準備を行います。
2. 「Drosophila NMJ Morphometrics」での分析にはDlg-1またはHrpとBrp、および「Drosophila NMJ Bouton Morphometrics」での分析にはSytまたはCspとBrpの2つのマーカーの組み合わせを使用して、Drosophila NMJ端末を共免疫標識します。
   注:同じ種由来の抗体は、Zenon Alexa Labeling Kitsなどの抗体標識キットで1つを事前に標識することで組み合わせることができます。
3. 蛍光顕微鏡(ApoTomeの有無にかかわらず)または共焦点顕微鏡など、選択した顕微鏡を使用してNMJ端末をイメージングします。
   1. NMJ端子の2チャンネル画像スタックを取得します。
      1. チャンネル1がDlg-1(またはHrp、Syt、Csp)で免疫標識されたNMJ端末を取得し、チャンネル2がBrpで免疫標識されたNMJ端末を取得するように、顕微鏡の設定を調整します。
      2. オプションで、マクロを使用して(単一の抗体で免疫標識されたシナプスの)1チャンネル画像を解析します。「Drosophila NMJ Morphometrics」で分析するためにDlg-1またはHrpで一意に免疫標識されたNMJの画像、または「Drosophila NMJ Bouton Morphometrics」のSytまたはCsp.
         注:抗BRP剤のみで免疫染色されたシナプスを解析することはできません。
   2. 取得した画像を個別の.tiffファイルとしてエクスポートします。マクロを実行する前にチャネルの順序を反転します。示されているとおりに取得されない場合は、マクロを実行します。

2. ソフトウェア要件とインストール

1. 次のWebサイトからマクロ「Drosophila NMJ Morphometrics」および「Drosophila NMJ Bouton Morphometrics」をダウンロードします:https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1。
2. カーソルを「Macros update 1」フォルダに移動し、表示されるオプション「view」をクリックします。このフォルダの内容のリストが表示されます。このフォルダには、マクロ "Drosophila NMJ Morphometrics" と "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" が含まれています。
   注:どちらのマクロも、同じフォルダにある Fiji バージョン 1.4 と互換性があります。マクロは、最近のバージョンでは実行できない場合があります。提供されているバージョン1.4をご利用ください。このバージョンを起動するのは、より新しいフィジーバージョンが利用可能なコンピューターでも問題ありません。
3. 「すべてダウンロード」をクリックします。フォルダの内容は、.zipファイルとしてコンピューターにダウンロードされます。ダウンロードしたファイルを解凍します。
4. Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm ファイルと Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm ファイルをディレクトリ Fiji.app/plugins/ にコピーします。プログラムを再起動すると、マクロは [プラグイン] ドロップダウン メニューの下部に表示されます。

3. サブマクロ「Convert to Stack」を実行して、NMJ画像のZ投影とハイパースタックを作成します

1. ツールバーの「プラグイン」を選択し、ドロップダウンメニューで「Drosophila NMJ Morphometrics」を選択してグラフィカルインターフェースを起動します。
2. マクロのグラフィカル・インターフェースで「ユニーク・ファイル・ストリング」設定を定義します。
   注:顕微鏡ソフトウェアは、スタックを個々の「.tiffファイルとして保存する際に、識別署名を使用して平面とチャンネルを整理します。入力された一意のファイル文字列設定では、ソフトウェアによって最初のチャネルの最初のプレーンに割り当てられた署名を指定する必要があります(重要:最小のプレーンとチャネル番号を指定する必要があります)。
3. サブマクロ「スタックに変換」のみを選択し、「OK」をクリックして、画像が配置されているフォルダを選択します。複数のサブフォルダを持つメインディレクトリが選択されている場合、一意のファイル文字列条件に一致するメインディレクトリとサブフォルダ内のすべての個々の.tiffファイルが処理されます。
   1. zスタックにチャネルが1つしかない場合は、[チャネル1のみ]ボックスを選択します。
4. NMJイメージごとに2つの新しいファイル(デフォルトではstack_image_nameとflatstack_image_nameと呼ばれる)が表示されます。これらのスタックとフラットスタックのみを保存して、さらに分析します。.tiffファイルシリーズはこの時点で削除できるため、必要なストレージ容量を最小限に抑え、潜在的なエラーの原因を回避できます。

4. サブマクロ「Define ROI」を実行して、対象のNMJターミナルを描き

1. 「ショウジョウバエNMJモルフォメトリクス」のグラフィカルインターフェースを起動します。
2. 「ROIの定義」チェックボックスのみを選択して「OK」を押し、flatstack_nameと題された画像が保存されているメインディレクトリを選択して「選択」を押します。サブマクロ「Define ROI」は、選択したメインディレクトリ内のすべてのサブフォルダを自動的に検索します。
3. 最初の投影が開いたら、ツールバーの「フリーハンド選択」ツールを選択します。
4. マウスを使用して、目的のNMJターミナル全体を含む選択を描画し、「ターミナルの定義」ウィンドウで「OK」をクリックします。マクロは次の投影で進行します。
5. 次の ROI を定義し、すべての ROI が定義されるまで繰り返します。「roi_image_name」という名前のROIイメージファイルは、処理された各イメージに対して以前に生成されたスタックイメージとプロジェクションイメージと同じディレクトリに保存されます。このサブマクロの出力は、黒の背景に白で表示された ROI のバイナリ イメージです。

5. サブマクロ「Analyze」を実行してNMJターミナルの特徴を定量化します。

1. ツールバーに移動し、「プラグイン」を選択して、以下を使用します:
   抗Dlg-1または抗Hrp(チャネル1)で免疫標識されたシナプス(チャネル1)と抗Brp(チャネル2)を併用して解析する場合は「ショウジョウバエ_NMJ_Morphometrics」、抗Sytまたは抗Cspで免疫標識されたシナプス(チャネル1)をBrp(チャネル2)とともに解析する場合は「ショウジョウバエ_NMJ_Bouton_Morphometrics」。
   1. 1つのチャンネル画像スタックを解析する場合(「Drosophila_NMJ_Morphometrics」の構造チャンネルDlg-1またはHRP、「Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics」のSytまたはCsp)、「チャンネル1のみ」のボックスを選択します。
2. 解析する画像に応じて縮尺を調整します。
   1. 画像内の 1 つのピクセルが 2.5 μm に対応する場合は、Scale-Pixels = 1、Scale-Distance in μm = 2.5 と指定します。両方の設定を0のままにした場合、NMJの面積、周囲長、長さ、最長分岐長はピクセル数で表されます。
3. 必要に応じて、マクロの既定の分析設定を調整します。調整は、サブマクロの「分析」が以前に実行され、満足のいく結果が得られなかった場合にのみ実行してください (設定の最適化方法については、このセクションの最後とセクション 6 を参照してください)。
4. 「分析」と「待機」のチェックボックスを選択し、「OK」を押します。
   1. サブマクロ「解析」を2チャンネル画像に対して実行する場合は、「待機」チェックボックスを選択します。そうしないと、コンピュータ容量の制限により、アクティブゾーンカウントでエラーが発生する可能性があります。
5. 新しいウィンドウ「ディレクトリの選択」が開いたら、画像が配置されているディレクトリを選択して「選択」を押します。このマクロは、メイン ディレクトリと、該当する場合は後続のフォルダ (前のサブマクロの実行から得られた 3 つのファイル (stack_image_name、flatstack_image_name、roi_image_name) を使用して) に保存されているすべての画像を分析します。マクロは、各画像を個別に連続して処理します。これには、イメージ スタックごとに数分かかる場合があります (コンピューターの容量によって異なります)。
6. マクロの実行後、保存されている分析された各シナプスに対して res_image_name という名前の新しいイメージ ファイルが親フォルダに作成されることに注意してください。定量的な測定値は「results.txt」ファイルとして保存されます。
7. すべての結果画像を調べて、セグメンテーションエラーのある画像を検出して除外します。表 1 では、発生する可能性のあるセグメンテーション エラーと、これらのエラーを回避するための設定の調整方法のアドバイスについて説明します。このようなセグメンテーションエラーを含む結果画像は、例として 図 1.
   に示されています。 注:ユーザー インターフェイスで観察されたデフォルト設定でマクロを実行した場合、マクロ評価と手動評価を比較したときの精度は約 95% でした。

6. マクロ設定を画像に合わせて調整します

1. 画像の5%以上でセグメンテーションエラーが見られる場合は、さまざまなアルゴリズムを調べて、画像に最適なマクロ設定を定義/選択します。
2. 転がり球の半径値を調整します
   注:ローリングボール半径関数は、画像の背景を減算します。この機能は、蛍光顕微鏡で取得した画像を扱う場合や、画像に高いバックグラウンドノイズがある場合に非常に重要です。背景の減算は、マクロの自動しきい値処理ステップで NMJ 端子の適切なセグメンテーションを生成するのに役立ちます。
   1. サブマクロ「Convert to stack」で生成されたNMJ stack_image_name画像を3枚選択します。画像データセットを代表する画像を選択します。
   2. ツールバーで、[画像] |カラー |チャンネルを分割します。2 つの画像スタックが作成され、1 つはチャネル 1 を表し、もう 1 つはチャネル 2 を表し、保存されます。
   3. チャネル1に属する画像スタックを開きます。これは、Dlg-1、Hrp、Syt、またはCsp免疫標識に対応します。
   4. ツールバーの「プロセス」を選択し、ドロップダウンメニューの「背景の減算...」を選択して、フィルター「背景の減算」を実行します。
   5. ポップアップウィンドウのプレビューチェックボックスをクリックして、転がるボールの半径を画像に最も適した値に調整します。「Rolling ball radius」の設定は、シナプスと背景の間のコントラストが大きくなる値に調整する必要があります (図 2A' を参照)。
      1. 例については、図 2 を参照してください。パネル A では、シナプスの一部は背景と同じ灰色レベルを示していますが、図 2 のパネル A' では、"Rolling ball radius" が 500 であるため、シナプスと背景の間に強いコントラストが生じます。
   6. ツールバーの [画像] |スタック|Z 投影を選択し、投影タイプ = 最大強度を選択し、結果の画像を保存します。転がるボールの半径に適切な値が定義されたら、同じ転がるボールの半径値を持つ残りの代表的な画像に対して「背景の減算」アルゴリズムを実行します。Z 投影法を作成し、(任意のディレクトリに)保存します。
      注:8 ビットまたは RGB イメージのローリング ボール半径値は、背景の一部ではないイメージ内の最大のオブジェクトの半径と少なくとも同じ大きさにする必要があります。16 ビットおよび 32 ビットの画像の場合、半径はピクセル値の範囲に反比例する必要があります。
3. 使用するさまざまな自動しきい値を決定します
   1. 前の手順(6.2.6)で保存したZ投影を開き、[画像]を選択します|調整 |オートスレッショルド |すべて試してみてください。
   2. バイナリしきい値の結果画像がすべての異なる自動しきい値アルゴリズムで表示されるため、画像に最適なアルゴリズムを決定します。
      1. 後でマクロを実行するときは、それに応じてマクロ設定のしきい値を変更します。
      2. NMJ アウトラインしきい値として "RenyiEntrophy" や "Moments" などのより制限の厳しいしきい値を使用し、NMJ スケルトンを決定するために "Li" やアクティブ ゾーンを決定するために "Huang" などのより許容性の高いしきい値を使用します。画像が非常にシャープで背景がほとんどまたはまったくない場合は、「Huang」を「NMJアウトラインしきい値」として使用します。そうしないと、画像のセグメンテーション後にシナプスの一部が欠落する可能性があります。
      3. 例については、図 2B を参照してください。シナプスの適切なセグメンテーションは、緑色のボックスで強調表示された自動しきい値で取得されます。不適切な閾値の例としては、赤いボックスで強調表示されています (高倍率でシナプスを確認してください)。後者では、シナプスの一部が欠落しているか、背景の一部が含まれています。
4. 小さな粒子の最大サイズを決定します
   注:この機能は、NMJアウトライン閾値とスケルトン閾値によって検出されたすべての粒子のうち、「small particles setting」で定義された値よりも小さいものを解析から除外します。この値はピクセル単位で定義されます。この機能はノイズフィルターとして機能し、取得した画像に不均一な背景(結晶/ほこりなど)が高率で存在する場合に非常に役立ちます。
   1. 手順6.2.6.で保存したZ投影を開き、Analyze |スケールを設定します。次の設定を適用します:ピクセル単位の距離= 1、既知の距離= 1、ピクセルのアスペクト比= 1、長さの単位= ピクセルを押して、「OK」を押します。ツールバーの「楕円選択」ツールをクリックします。
   2. マウスを使用して、免疫染色に存在するがNMJに属さない単一の粒子を密接に囲む選択を描きます。Windowsユーザーの場合はCtrl + mを、Macユーザーの場合はcmd + mを押します。結果表示ウィンドウが開き、選択したパーティクルの面積がピクセル数で示されます。
   3. 画像にいくつかのアーティファクトが存在する状態で前の手順を数回繰り返して、最大の汚染粒子/アーティファクト領域を特定します。これは、後でマクロを実行するときに設定で設定する値になります。マクロを実行するときは、観察された最小の粒子サイズとして [Small Particles Size] を設定し、膿のマージンを 25% に設定します。
   4. 例については、図 2D を参照してください。検出された最大の水晶の面積は 112 ピクセルです。この画像をマクロで処理する場合、「小さな粒子サイズ」設定は125〜150に設定する必要があります。
5. 最小ボタンサイズを決定します
   注:この機能は、NMJアウトラインしきい値によって検出された、定義された値よりも小さいすべてのブートンを解析から除外します。この値はピクセル単位で定義されます。
   1. セクション6.4で説明したのと同じ手順に従いますが、この場合は、NMJ端子に存在する最小のボタンを選択するように描画します。測定されたものの最小のボタンに対応する最小の領域を選択します。これは、後でマクロを実行するときに最小ボタン サイズ設定で設定する値です。
6. 「最大ノイズ許容値」の定義
   1. マクロの [Find maxima noise tolerance] 値を定義するには、セクション 6.2.2 で保存したチャネル 2 の Z スタックを開きます。
   2. ポップアップメニューのプラグインタブに移動し、プロセス|最大(3D)、maximum_image_nameが表示されたら(数分かかる場合があります)、元の画像スタックを閉じます。
   3. Maximum..._image_name (新しく取得したイメージ スタック) を選択し、[プラグイン] |プロセス |最小 (3D): 新しい画像 [最小] が [Maximum..._image_name] になったときに [最大] _image_name スタックが閉じます。
   4. ツールバーで、[プロセス] |最大値を見つける....新しいウィンドウ「Find maxima...」が開きます。「プレビューポイント選択...」チェックボックスをクリックし、「ノイズ許容範囲」ボックスにデフォルトのマクロ設定50を入力します。最大点は、画像内で小さな十字として示されます。
      1. 注釈が付けられたアクティブゾーン、つまり、選択したスタックプレーンにフォーカスされていないアクティブゾーンの上にない交差、またはバックグラウンドで検出された偽のアクティブゾーンが過剰に観察される場合は、[ノイズ許容値]の値を増やします。
         1. 一方、不完全な注釈が付けられたアクティブゾーン、つまりフォーカスのあるアクティブゾーンが認識されていないことを観察する場合は、「最大ノイズ許容値」の値を小さくします。この手順に従って、十字が焦点の合ったアクティブゾーンに適切にラベルを付けるまで、さまざまな値を試し続けます。「Find maxima noise tolerance」にこの値を入力します。
         2. 例については、図 2C を参照してください。検出されたアクティブ ゾーンが多すぎます。図 2C' では、「最大ノイズ許容値」の値を増やすと、焦点が合っているアクティブ・ゾーンのみが検出されます。
   5. ステップ 5.1 で選択した代表的な画像に対して、前のすべてのステップで定義された設定を使用して、サブマクロ「分析」を実行します。
7. Brp-puncta の下限と上限の閾値を調整する
   1. ステップ 6.6 に従ってマクロを実行した後、新しいファイル (2_active_zone_stack_image_name) が表示されることに注意してください。この画像スタックでは、「Find maxima」機能によって検出されたアクティブゾーンは、各平面に白い点で示されています。
   2. このファイルをツールバーにドラッグアンドドロップして開き、[画像] |スタック |Zプロジェクト |投影タイプ = スライスの合計。2_active_zone_stack_image_nameの投影が取得されます。
   3. 画像を選択 |調整 |閾。新しいウィンドウ「しきい値」が開きます。上部のバーをスライドしてしきい値を選択すると、必要なすべての病巣/Brp陽性スポットが赤で視覚化されます
      注:しきい値の設定が低すぎると、過剰なアクティブゾーンがカウントされます。設定が高すぎると、アクティブなゾーンの一部が失われます。
      1. 例については、図 2E を参照してください。しきい値を 400 に設定すると、ほとんどのアクティブ ゾーン (1 ピクセルの焦点としてシンボル表示) は、赤で強調表示されないため (図 2 E) ため、セグメンテーションに含まれません。しきい値が 50 に設定されている場合、すべてのアクティブ・ゾーンは赤で強調表示されます (図 2、E')。
   4. この値を最小しきい値として定義します。「上限しきい値の上限」は最大値のままにします。
   5. 代表的な画像に対してサブマクロ「分析」を再実行し、このセクションの前のすべての手順で定義した設定を使用します。結果の画像ファイルを批判的に評価し、セグメンテーションが適切に行われていることを確認します。そうでない場合は、セグメンテーション・エラーの性質に応じて設定を再調整してください (図 1、表 1)。

図1:不適切なマクロセグメンテーション結果の例。「Drosophila NMJ Morphometrics」または「Drosophila NMJ Bouton Morphometrics」を実行した後の結果画像。シナプス末端の一部は黄色の枠線(A)に含まれていません。背景の一部は、黄色の輪郭(B)によってシナプス末端に含まれています。青いスケルトンラインはシナプス終末(C-D)を超えて伸びています。検出されたアクティブ ゾーンが多すぎます (E - E')。一部のアクティブゾーンは、解析によって検出されないままです(G - G')。アクティブゾーンはシナプス(F)の外側で検出されます。誤ったブートンセグメンテーション(ショウジョウバエNMJブートンMorphometricsを実行している場合にのみ適用可能)、ブートンが欠落している(H)、またはセグメンテーションによって検出されるブートンが多すぎる(I)。背景の一部である結晶や塵などの粒子は、セグメンテーション(J)に含まれます。これらのエラーを回避するための設定変更方法については、表 1 を参照してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マクロ設定の調整例と画像セグメンテーションへの影響。(A)「ローリングボール半径」が20(A)または500(A')に設定されている場合、ApoTomeを使用して蛍光顕微鏡で画像化されたDlg-1免疫標識シナプスのバックグラウンドプレビューを差し引きます。(B) 実行後に取得した出力画像 Image |調整 |自動しきい値 |「Try all」の画像は、16 種類の自動しきい値アルゴリズムによって取得された画像セグメンテーションを示しています。(C)「ノイズ許容範囲」を50(C)および500(C ')に設定した場合の「最大値を求める」プレビュー。セグメンテーションによって検出されたアクティブ ゾーンには、小さな十字でラベルが付けられます。(D)共焦点顕微鏡で画像化された、抗Hrpで免疫標識されたシナプスの画像背景に現れる「小さな粒子」の測定。(E)2_active_zone_stack_ima-ge_nameから得られる「合計スライス」投影。しきい値は 400 (E) と 50 (E') に設定されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

>表 1: マクロによって生成される可能性のある画像セグメンテーションのさまざまなエラーのトラブルシューティング ガイド。次の表では、マクロによって生成されるさまざまな種類の画像セグメンテーション エラーについて説明します。これらは、結果画像で簡単に検出できます。各エラー・タイプの例を図 1 に示します。表の「調整セクション」では、調整が必要な設定が強調表示され、ユーザーはこれらの設定を調整する方法を説明するセクション 6 の重要なサブステップを参照します。