2光子レーザーによる神経損傷:ショウジョウバエ幼虫の軸索変性と再生の観察法

要約

出典:Li, D., et al. 末梢および中枢神経系の神経再生を研究するためのショウジョウバエの生体内損傷モデル。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、Drosophila melanogaster幼虫の軸索の2光子レーザーアブレーションと、損傷を誘発して損傷部位を画像化するためのプロトコルの例について説明しています。

プロトコル

このプロトコルは、Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018)からの抜粋です。

1. 二光子損傷と共焦点イメージング

1. 顕微鏡のセットアップ
   注:この実験には、2光子レーザーを用いた共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用しましたが、同等のセットアップを持つ他のシステムでも十分です。2光子レーザー(930 nm)は損傷の送達に使用され、アルゴンレーザー(488 nm)はGFPの共焦点イメージングに使用されました。
   1. 各セッションの開始時に、2光子レーザーおよび/または共焦点レーザー、および顕微鏡の電源を入れます。イメージングソフトウェアを開きます。
   2. 2光子損傷の場合、930 nm(1,950 mW)の2光子レーザーでGFPをイメージングするために、次のパラメータを設定します。
      1. ラインスキャンモードを選択します。ピンホールをいっぱい開けます。レーザー強度を~20%(390 mW)に増やします。
      2. フレームスキャンとして 512 x 512 を選択します。スキャン速度は最大にします (通常はピクセル滞留時間を 0.77 μs とします)。平均数が 1 で、ビット深度が 8 ビットであることを確認します。
      3. ゲインを ~750 に設定し、オフセットを 0 に設定します。
      4. この事前設定された実験プロトコルを2P GFP 930アブレーションとして保存すると、将来の実験で簡単に再利用できます。
   3. 共焦点イメージングでは、488 nmのアルゴンレーザーでGFPをイメージングするために、以下のパラメータを設定します。
      1. [Acquisition] タブを選択し、[Z-stack] を選択します。
      2. 「レーザー」で、488nmアルゴンレーザーの電源をオンにします。
      3. [チャンネル]に移動し、488 mmレーザーを選択して、レーザー出力を5〜10%に増やします。ピンホールには、1-2エアリーユニット(AU)を使用してください。ゲインを650に調整します。
      4. [Acquisition Mode] で、フレーム スキャンとして [1024 x 1024] を選択し、最大スキャン速度、平均数 2、ビット深度 8 ビットを使用します。
      5. この事前設定された実験プロトコルをGFP Imagingとして保存します。
2. ジエチルエーテルによる幼虫麻酔とマウンティング
   1. ドラフトで、60 mmのガラス皿を15 cmのプラスチック製ペトリ皿に入れます。ガラス皿の底にティッシュペーパーを折りたたんで置き、その上にブドウジュース寒天プレートを置きます。ティッシュペーパーが浸り、皿に液体エーテルの層が残っている点まで、ガラス皿にジエチルエーテルを追加します。常に蓋を閉めたままにしてください。
   2. 中央にハロカーボン27オイルを1滴垂らしたスライドガラスを用意します。スライドの四隅に4つの真空グリーススポットを追加して、後でカバーガラスを支えます。
   3. 鉗子を使用して洗浄された幼虫を拾い上げ、60mmのガラス皿の寒天プレートに置きます。ガラス皿を蓋で覆い、幼虫の動きが止まるまで待ちます。PNSの損傷/画像診断の場合は、尻尾のけいれんが止まったらすぐに幼虫を取り出します。中枢神経系の場合は、幼虫全体、特に頭部が動かなくなるまで待ちます。
      注:エーテル曝露のタイミングは重要です。ディスカッションを参照してください。
   4. 麻酔をかけた幼虫を慎重に拾い上げ、スライド上のハロカーボンオイルの滴に頭を立てて置きます。スライドの上にカバースリップを追加します。カバーガラスが幼虫に触れるまで、カバーガラスを穏やかに押し下げます (図 1A)。
   5. カバースリップを左または右にそっと押して幼虫を転がし、目的のニューロン/軸索/樹状突起が顕微鏡レンズの上部に最も近いようにして、幼虫の位置を調整します。
   6. PNS損傷の場合は、幼虫の背側を上にして取り付け、両方の気管が見えるようにします。次に、幼虫を左に~30度回転させてクラスIIIのニューロン軸索を損傷し(図1Bおよび1C)、クラスIVの損傷を左右に90度(図1Bおよび1E)、またはクラスIVの損傷で~30度ニューロンの樹状突起(図2A)を回転させます。
   7. 中枢神経系損傷の場合は、幼虫を完全に腹側を上にして配置し (図 3A)、関心領域が z 平面の顕微鏡レンズに最も近くなるようにします。
3. 2光子レーザーによる傷害
   1. 幼虫と一緒にスライドを顕微鏡の下に置き、ステージ上のスライドホルダーで所定の位置に固定します。10X (0.3 NA) 対物レンズを使用して幼虫を見つけます。
   2. カバーガラスに対物レンズオイルを1滴加え、40X(1.3 NA)対物レンズに切り替えてピントを調整します。
   3. スキャンモードに切り替えて、実験プロトコルの2P GFP 930アブレーションを再利用します。ピンホールが完全に開いていることを確認してください.
      注:構成は、個々のシステムに基づいて最適化する必要があります。
   4. ライブモードを開始して関心領域(ROI)を特定し、設定を微調整して適切なズームで良好な画質を実現します。
      注:このステップの目的は、最高品質の画像を撮影するのではなく、損傷するニューロン/軸索/樹状突起を見つけることです。したがって、露出オーバーや光退色を避けるために、ターゲット領域を視覚化するのに十分な最小限の設定を使用してください。
   5. ライブスキャンを停止して、切り抜きボタンが使用可能になります。静止画をロードマップとして活用しましょう。クロップ機能を選択し、スキャンウィンドウを調整して、負傷するターゲットに焦点を合わせます。
   6. ROIを損傷の可能性のある場所のサイズに縮小します。たとえば、軸索または樹状突起の幅を覆うだけで、損傷の精度を確保し、隣接する組織への損傷を減らすことができます。必要に応じて、トリミングする前にROIを拡大し、より正確な傷害を可能にします。
   7. 新しいイメージングウィンドウを開きます。スキャン速度を下げ、レーザー強度を上げます。Liveモードでスキャンされた組織蛍光シグナルに基づいて、レーザー強度の増加を決定します。
   8. 通常、2光子レーザー強度は、PNS損傷の場合は25%、VNC損傷の場合は50〜100%から開始します。PNS 軸索損傷の場合、レーザー強度が ~480 mW で、ピクセル滞留時間が 8.19 μs であることを確認してください。VNC軸索損傷の場合、レーザー強度とピクセル滞留時間が通常965-1930 mWと8.19-32.77 μsであることを確認してください。
   9. 連続スキャンを開始します。カーソルを「連続」ボタンの上に置いたままにします。画像を注意深く観察し、蛍光の急激な増加が観察されたらすぐにスキャンを停止してください。
      注:蛍光スパイクの出現は、損傷部位での自家蛍光によるものです。
   10. 設定を再利用してライブモードに戻します。フォーカスを調整して、ターゲットにしたばかりの関心領域を見つけます。
       注:怪我が成功したことを示す良い指標は、怪我の部位に小さなクレーター、リング状の構造、または局所的な破片が現れることです。
   11. 次のニューロンに移動し、ステップ1.3.5から繰り返して、1匹の動物の複数のニューロンを損傷します。または、最初の損傷が不十分だった場合は、徐々に出力を上げたり、スキャン速度を下げたりしながら、手順1.3.5を繰り返します。
       注:レーザー出力が高すぎると、損傷後のライブスキャン画像に大きな損傷領域が表示されます。怪我が多すぎると、幼虫が死亡する可能性があります。
   12. カバースリップを慎重に取り外し、負傷した幼虫をイーストペーストで新しいプレートに移すことにより、幼虫を回復します。鉗子で寒天板にいくつかの洞窟を捨てます。あるいは、プレート全体を使用する代わりに、プレート内に寒天の島を作り、幼虫がプレートから這い出す可能性を減らします。
   13. プレートを湿ったティッシュ(0.5%プロピオン酸溶液に浸した)を入れた60mmのシャーレに入れ、室温または25°C.
       で培養します 注:幼虫は、室温(22°C)で25°Cの場合と比較して、約1日余分に幼虫期に留まります。
4. 損傷後の共焦点イメージング
   1. ステップ1.2と同じ麻酔と埋込の手順を使用して幼虫を準備し、次に共焦点レーザーでイメージングすることにより、目的の時点で負傷した幼虫を画像化します><。 注:損傷後24時間(AI)で幼虫を画像化して軸索損傷を確認し、48時間AI(クラスIVニューロン)または72時間AI(クラスIIIニューロン)で再生を評価します。
   2. 10X対物レンズを使用して幼虫を見つけ、次に25X(0.8 NA)対物レンズに切り替えます。実験プロトコルGFP Imagingを再利用します。
   3. [ライブ]ボタンをクリックして、以前に負傷したのと同じニューロンを見つけます。
   4. ライブスキャンウィンドウの最初と最後のZ位置を設定します。stop キーを押しながら [実験の開始] をクリックして、Z スタック イメージを取得します。
      注:再生の定量化が可能になるように、画像をキャプチャする際に正規化点(軸索収束点)が含まれていることを確認してください（図1、D、1F)–これについては、データ分析セクションで詳しく説明します。
   5. 画像処理に切り替えて、撮影したばかりの画像を選択し、最大強度の投影を生成します。Z スタックと最大強度の投影画像の両方を保存します。

結果

図1:末梢のDaニューロン軸索再生はクラス特異性を示しています。(AおよびB)幼虫の位置を示す模式図。(C)クラスIIIのdaニューロンの概略図。(D)19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、repo-Gal80/+で標識されたクラスIIIのdaニューロンddaFの軸索は、再増殖に失敗します。(E)クラスIVのdaニューロンの概略図。(F)ppk-CD4-tdGFP/+で標識されたクラスIVのdaニューロンv'adaの軸索は、病変部位を超えて再成長します。(D、F)赤い線は軸索の長さを示し、緑の破線は細胞本体と軸索収束点(DCAC)との間の距離を示します。青い点は軸索の収束点を示します。スケールバー = 20 μm.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ジエチルエーテル、ACS試薬、無水	アクロスオーガニックス	AC615080010
ハロカーボン27オイル	ジェネシー・サイエンティフィック	59〜133
プロピオン酸	J.T.ベイカー	U33007
カバーグラス:長方形	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 レーザー走査型顕微鏡	ツァイス
Zenソフトウェア	ツァイス
カメレオンウルトラII	コヒーレント

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