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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
このプロトコルは、Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。
1. Live Cell ImagingのMBの設計
- mffoldサーバー(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)の「RNAフォーム」を使用して、ターゲットRNA配列をフォールドし、mRNAターゲットの二次構造を予測します。
- ターゲット配列をFASTA形式で貼り付け/アップロードし、5または10%のサブオプティリティ(それぞれMFE値の5または10%以内にフォールディングする自由エネルギーを持つ構造)を選択し、それに応じて計算されたフォールディングの最大数を調整します(たとえば、10%のサブオプティマルティリティで大きくなります)。
注:MBを設計する際に最適でない二次構造を含めることで、最小自由エネルギー(MFE)構造のみで予測されるよりも柔軟性が高いまたは硬直する可能性のある標的mRNA内の領域を特定でき、生細胞イメージングに適したMBの全体的な設計が改善されます。
- 800 nucleotides (nt) の mRNA ターゲットの場合は「immediate job」を、801 から 8,000 nt の mRNA 長の場合は「batch job」を選択し、「ss-count」ファイルを単純なテキストファイルとして保存します。
- ステップ1.1で取得した「ss-count」ファイルをPinMolプログラム(https://bratulab.wordpress.com/software/)の入力として使用し、mRNAターゲット用に数MBを設計します(PinMolプログラムの使用方法を説明するチュートリアルを参照してください>https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/)。
- BLAST分析を実施して、選択したMBの特異性を判断します:適切なデータベースで「blastn」を使用します(例:oskar mRNA特異的MBの場合は、「refseq-rna」データベースとDrosophila melanogaster生物を使用します)。
- mRNAターゲットの組織特異的発現を同定します(例:oskar mRNA Flybase>ハイスループット発現データ>FlyAtlas Anatomy MicroarrayまたはmodENCODE Anatomy RNA-Seq;http://flybase.org/reports/FBgn0003015)そして、陽性のBLASTヒットと比較します。目的の組織/細胞でも発現している他のmRNAと>50%の交差相同性を示すプローブを排除します。
- ライブセルイメージングに利用できる顕微鏡セットアップに適した蛍光色素とクエンチャーのペアを選択します(例:Cy5/BHQ2)。
2. MBの合成、精製、および特性評価
- Bratu, Methods in Molecular Biology (2006) で前述したように、社内での合成および精製を行い、1 〜 5 MB の MB(上記注を参照)を合成および精製するには、[5'(Fluorophore)-(C3 or C6 linker)-(2'-O-methyl MB sequence)-(Quencher)3']。逆相HPLCを使用してMBを精製するか、社内または商用プロバイダーのサービスを使用します.
注:自動プローブ合成に使用されるホスホロアミダイトは、2'-O-メチルリボヌクレオチド修飾を持っている必要があります。また、ロック核酸(LNA)と2'-O-メチル修飾を交互に組み合わせたキメラを使用して、短いMBとその標的mRNAとの間のハイブリッドの安定性を高めることもできます。
- 標的RNA領域の配列と一致するため、MBのプローブ領域に相補的なDNAオリゴヌクレオチドを合成し、in vitroの特性評価に使用します(ステップ2.3から2.5、上記注を参照)。DNAターゲットの各末端に、ターゲットmRNA配列に見られる4つの追加のヌクレオチドを含めることにより、MBとDNA-オリゴヌクレオチドターゲット模倣物とのハイブリダイゼーションを最大化します。
注:標的配列を検出するためのMBの効率のより厳密な特性評価は、相補的なDNAオリゴヌクレオチドの代わりにin vitroで合成されたRNAターゲットを使用して実行できます。
- MBのみの熱変性を行い、融解温度(Tm)を測定し、MBが生理学的温度で目的のヘアピン形状をとることを確認します。60〜90°CのTm値を観測しました。
- DNAオリゴヌクレオチドターゲットの存在下でMBの熱変性を行い、MB:DNAターゲットハイブリッドのTmを測定します(Bratu, Methods in Molecular Biology (2006))で前述したように。MB:DNAハイブリッドには、55〜60°CのTmが望ましいです。
- 対応するDNAオリゴヌクレオチドターゲットとin vitroハイブリダイゼーション反応を行い、Bratu, Methods in Molecular Biology(2006)で前述したように、生理学的温度でのMB:DNAハイブリッド形成の効率を決定します。DNAターゲット模倣体による高速ハイブリダイゼーション速度が望まれますが、DNAターゲットとのハイブリダイゼーション効率が高くないMBは、in vitroおよび/またはin vivoでターゲットmRNAに対してより優れたパフォーマンスを発揮する可能性があります。
3. マイクロインジェクション用個別卵室の解剖と調製
- 新しく孵化した交配した雌に2〜3日間、新鮮なイーストペーストを与えます。
- 麻酔はCO2パッド上を飛行し、細かいピンセット(Dumont #5)を使用して、ガラスカバースリップ上のハロカーボンオイル700の滴に1〜2匹のメスを移します。
- ピンセットを使用して、実体顕微鏡の下で背側を上にしてフライを向けます。後端に小さな切開をして女性の腹部を解剖し、一対の卵巣をオイルにそっと絞ります。
- 新しいカバースリップの油滴に卵巣を移植します。片方のピンセットで片方の卵巣をそっと持ち、もう片方のピンセットで卵巣の最も若い段階をつまみます。oskar mRNAは、卵形成中期(ステージ>7)以降に活発に局在し、若い卵室(ステージ<7)は注入がより困難で、長くは生存しません。カバースリップをゆっくりと(下向きに動かしながら)ドラッグして、個々の卵巣または卵室が分離され、垂直に整列します。さらに、卵子鎖から不要なステージを移動させることにより、単一の卵室を分離します.
注:個別にからかわれた卵室が油に浮かばないように、およびカバースリップに付着していることを確認してください。これは、マイクロインジェクションと画像取得の両方を成功させるために重要です。
4. 卵室のナース細胞へのMBsのマイクロインジェクション
- 1つの分子ビーコン(例:osk2216Cy5)を使用するか、異なるmRNAを標的とし、スペクトル的に異なる蛍光色素で標識された2つのMBを混合して(例:osk2216Cy5およびdrongo1111Cy3)MB溶液を調製します。HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7.5、1.5 mM MgCl2、100 mM NaCl) に各 MB 200-300 ng/μL の濃度を使用してください。HybBuffer (osk82、osk1236、osk2216 など) でそれぞれ 200 ng/μL の同じ mRNA を標的とする同じ蛍光色素で標識された 4 MB のカクテルの場合。マイクロインジェクションのために針をロードする直前にMB溶液をスピンダウンします。
- 目標を選択します。40倍オイル対物レンズは、適切な卵室を見つけ、マイクロインジェクションを行うために推奨されます。
- 解剖した卵チャンバーを備えたカバースリップを顕微鏡ステージに取り付けます。対物レンズをフォーカスポジションに置き、マイクロインジェクションに適した向きの、中期から後期の発達段階にある卵室を特定します(つまり、AàP軸が針先に垂直になり、卵子の近位にあるナースセル内で簡単に注入できます)。
- 針(市販または社内調製)に~1 μL MB溶液(ステップ1.1を参照)をロードし、マイクロインジェクターに接続します。D. melanogasterの卵室でのマイクロインジェクションでは、針(材料の表を参照)を顕微鏡ステージに対して<45°の角度(例:30°)に向け、いくつかのナース細胞に穴が開かないようにします。
- インジェクターを500〜1,000 hPaの注入圧力と100〜250 hPaの補償圧力でセットアップします(材料の表を参照)。
- ステージをゆっくりと動かして、卵室の空隙である油滴の領域を視野に持ち込みます。
- マイクロマニピュレーターのジョイスティックを使用して、針をオイルドロップにゆっくりと下げ、その先端を視野の周辺に向かって焦点を合わせます。
- 針の先端から空気を取り除き、針からの流れがあることを確認するための「クリーン」機能を実行します。
- 針をホームポジションに持ってきて、マイクロインジェクションする卵室に焦点を合わせてから、針を焦点に戻して卵室の端近くに配置します。
- 濾胞細胞とナース細胞を分離する膜にピントが合うように、対物レンズのZ位置を微調整します。
- 針をナースセルに挿入し、2〜5秒間注射を行います。
- 針をそっと取り外し、ホームポジションに引っ込めます。
- 対物レンズを画像取得に必要な倍率(60-63倍または100倍)に変更し、卵室に焦点を合わせて、取得を開始します。