ショウジョウバエ看護師細胞のマイクロインジェクション:細胞内送達の方法

要約

出典:Catrina, I. E., et al. 生きたショウジョウバエの卵室における内因性mRNAの可視化と追跡。J. Vis. Exp.(2019年)。

Drosophilaのナースセルは、その大きなサイズと比較的単純な組織のために、生細胞イメージング研究に最適です。このビデオでは、外因性化合物を細胞内に導入するためのマイクロインジェクション法について説明しており、注目のプロトコルでは、内在性mRNA転写産物を可視化するために使用される分子ビーコン(MB)と呼ばれる蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用した手順を実演しています。

プロトコル

このプロトコルは、Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。

1. Live Cell ImagingのMBの設計

1. mffoldサーバー(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)の「RNAフォーム」を使用して、ターゲットRNA配列をフォールドし、mRNAターゲットの二次構造を予測します。
   1. ターゲット配列をFASTA形式で貼り付け/アップロードし、5または10%のサブオプティリティ(それぞれMFE値の5または10%以内にフォールディングする自由エネルギーを持つ構造)を選択し、それに応じて計算されたフォールディングの最大数を調整します(たとえば、10%のサブオプティマルティリティで大きくなります)。
      注:

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
分光蛍光光度計	フルオロマックス-4 堀場ジョビン イヴォン	該当なし	フォトンカウンティング分光蛍光光度計
石英キュベット	Fireflysci(旧プレシジョンセルズ社)	701MFLの
デュモン #5 ピンセット	世界の精密機器	501985	細いピンセットは、個々の卵室を分離するために非常に重要です
ハロカーボンオイル700	シグマ・アルドリッチ	H8898-J
カバースリップNo.1 22mm×40mm	VWRの	48393-048
解剖顕微鏡	ライカMZ6 ライカマイクロシステムズ株式会社	該当なし
CO2ショウジョウバエ麻酔パッド	ジェネシー・サイエニフィック	59〜114
トリスHCL pH 7.5	シグマ・アルドリッチ	1185*53-1
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	7791*18*6
NaCl	シグマ・アルドリッチ	〒7647*14-5
スピニングディスク共焦点顕微鏡	横河電機CSU10回転ディスクを搭載したライカDMI-4000B倒立顕微鏡 ライカマイクロシステムズ社	該当なし
浜松 C9100-13 ImagEM EMCCDカメラ	浜松	該当なし
PatchMan NP 2 マイクロマニピュレーター	エッペンドルフ株式会社	920000037
FemtoJetマイクロインジェクター	エッペンドルフ株式会社	920010504
注射針:フェムトチップII	エッペンドルフ株式会社	930000043
ローディングチップ:20μLマイクロローダー	エッペンドルフ株式会社	930001007
マイクロカバーグラス No.1または1.5、22 mm x 40 mm	VWRの	48393-026; 48393-172
ドライイースト	どんな食料品店でも	該当なし
コンピューター、> 20 GB RAM			処理はほとんどのコンピューターで実行できますが、機能が高いほど処理速度が速くなります

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