$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
このプロトコルは、Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018)からの抜粋です。
1. ハエの遺伝学とスクリーニング (図 1 と図 2)
- 注入された胚が成体に成長したら、単一のG0フライをバランサーフライに交配します。標的対立遺伝子を含む染色体に適したバランサーを選択します。
- CO2パッド上の各G0クロスからF1の子孫を麻酔し、実体顕微鏡で10〜20人のオスをランダムに選択します。それらを個別にバランサーのメスに渡します 図 2 に示します。
- F2幼虫が孵化したら、各交配から単一のF1父親を選び、シングルフライゲノムDNA調製プロトコルを使用してgDNAを抽出します。
- gDNA抽出バッファーを調製:10 mM Tris-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM NaCl、室温で保存します。20 mg/mLのプロテイナーゼKストック溶液を調製し、冷凍庫で保存します。
- 各フライを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに入れ、チューブにラベルを付けます。-80°Cの冷凍庫に一晩保管してください。
- 最終濃度のプロテイナーゼK.
を200 μg/mL含むgDNA抽出バッファーの新規作業量を調製します。
注: この手順では、古いバッファーを使用しないでください。
- 液体を分注せずに、50 μLのスキッシングバッファーが入ったピペットチップで各フライを10〜15秒間スクイッシュします。残りのバッファーをチューブに分注し、よく混合します。37°Cで20〜30分間インキュベートします。
- チューブを95°Cのヒートブロックに1〜2分間入れて、プロテイナーゼKを不活性化します。
- 10,000 x gで5分間スピンダウンします。調製物を4°Cで保存し、さらなるPCR分析を行います。
- 同じ方法を使用して、ネガティブコントロールとして機能するnos-Cas9フライからgDNAを調製します。3ステップのPCRベースのスクリーニングを実施して、各F1オスのgDNAをテンプレート5として使用して、正しい「エンドアウト」HDR(図1、図3)を特定します。以下のPCR反応システムでDNA調製液1 μLを使用します:2x PCR Master Mix with Dye 10 μL、各プライマー(10 μM)1 μL、DNAテンプレート1 μL、ddH2O7 μL。
- 図3 Aに示すように、プライマーfwd1およびrev1を使用してPCRを行い、挿入または置換の存在をスクリーニングし、fwd2およびrev2プライマーを使用してPCRを行い、3'領域からの挿入または置換を確認し、プライマーM13Fおよびrev3を使用してPCRを行い、HDRの「エンドイン」を確認します(表1C)。
- フライラインは確認済みのエンドアウトHDRで保持し、F2世代からバランスの取れたストックを確立します。バランサーへのアウトクロスは、他の染色体上の意図しない突然変異を取り除くために再び飛んで
いきます。
