ゲノム修飾のスクリーニング:ショウジョウバエのCRISPR生成変異体を同定する方法

要約

出典:Du, L., et al. ゲノム編集によるショウジョウバエの組織特異的バイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、CRISPR-Cas9を使用してゲノムを改変したトランスジェニックショウジョウバエを特定するためのスクリーニング方法を説明しています。CRISPR-Cas9は、科学者が生物のゲノムを操作する方法に革命をもたらした強力なゲノム編集ツールです。このプロトコル例では、トランス活性化配列の挿入によりブランチレス(bnl)遺伝子の最初のエクソンが置き換えられ、bnl遺伝子特異的なドライバーラインであるbnl-LexAが作られる、CRISPRで生成された変異体を同定する方法を見ていきます。

プロトコル

このプロトコルは、Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018)からの抜粋です。

1. ハエの遺伝学とスクリーニング (図 1 と図 2)

1. 注入された胚が成体に成長したら、単一のG₀フライをバランサーフライに交配します。標的対立遺伝子を含む染色体に適したバランサーを選択します。
2. CO2パッド上の各G0クロスからF1の子孫を麻酔し、実体顕微鏡で10〜20人のオスをランダムに選択します。それらを個別にバランサーのメスに渡します 図 2 に示します。
3. F2幼虫が孵化したら、各交配から単一のF1父親を選び、シングルフライゲノムDNA調製プロトコルを使用してgDNAを抽出します。
   1. gDNA抽出バッファーを調製:10 mM Tris-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM NaCl、室温で保存します。20 mg/mLのプロテイナーゼKストック溶液を調製し、冷凍庫で保存します。
   2. 各フライを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに入れ、チューブにラベルを付けます。-80°Cの冷凍庫に一晩保管してください。
   3. 最終濃度のプロテイナーゼK.
      を200 μg/mL含むgDNA抽出バッファーの新規作業量を調製します。 注: この手順では、古いバッファーを使用しないでください。
   4. 液体を分注せずに、50 μLのスキッシングバッファーが入ったピペットチップで各フライを10〜15秒間スクイッシュします。残りのバッファーをチューブに分注し、よく混合します。37°Cで20〜30分間インキュベートします。
   5. チューブを95°Cのヒートブロックに1〜2分間入れて、プロテイナーゼKを不活性化します。
   6. 10,000 x gで5分間スピンダウンします。調製物を4°Cで保存し、さらなるPCR分析を行います。
4. 同じ方法を使用して、ネガティブコントロールとして機能するnos-Cas9フライからgDNAを調製します。3ステップのPCRベースのスクリーニングを実施して、各F1オスのgDNAをテンプレート5として使用して、正しい「エンドアウト」HDR(図1、図3)を特定します。以下のPCR反応システムでDNA調製液1 μLを使用します:2x PCR Master Mix with Dye 10 μL、各プライマー(10 μM)1 μL、DNAテンプレート1 μL、ddH₂O7 μL。
5. 図3 Aに示すように、プライマーfwd1およびrev1を使用してPCRを行い、挿入または置換の存在をスクリーニングし、fwd2およびrev2プライマーを使用してPCRを行い、3'領域からの挿入または置換を確認し、プライマーM13Fおよびrev3を使用してPCRを行い、HDRの「エンドイン」を確認します(表1C)。
6. フライラインは確認済みのエンドアウトHDRで保持し、F2世代からバランスの取れたストックを確立します。バランサーへのアウトクロスは、他の染色体上の意図しない突然変異を取り除くために再び飛んで
いきます。

結果

図1:CRISPR/Cas9を介したゲノム編集によるバイナリ転写システムの生成ワークフローの概要。各ステップに必要なおおよその時間が示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ゲノム編集されたフライ系統を確立するためのCRISPRスクリーニングと遺伝的クロススキームの図。遺伝的交配では、Rは3^番目の染色体上にある編集された対立遺伝子を表しま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリス-HCl	シグマ・アルドリッチ	T3253	分子生物学
EDTAの	シグマ・アルドリッチ	E1161	分子生物学
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S7653	分子生物学
UltraPure DNase/RNaseフリー水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10977-023	分子生物学
プライマー	IDT-DNAの		PCR検査
プロテイナーゼK	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25530049	分子生物学
2x PCR PreMix、色素(赤)入り	シドラブ	MB067-EQ2Rの	分子生物学
MKRS/TB6B	コーンバーグ研究室		フライライン
CO2ステーション	ジェネシー・サイエンティフィック	59から122WCU	フライプッシング
実体顕微鏡	オリンポス	SZ-61	フライプッシング
マイクロチューブ均質化乳棒	フィッシャーサイエンティフィック	03-421-217	ゲノムDNA単離

の (代表)