成虫ショウジョウバエの頭部のパラフィンへの埋め込み:組織学のための組織の準備

要約

出典:Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. ショウジョウバエの神経変性を定量化するための質量組織学.J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、ショウジョウバエの頭部をパラフィンに埋め込む方法、つまりフライヘッドをシリアルセクショニング用に準備する技術であるカラー法を使用して説明しています。パラフィン切片は、脳の解剖学的構造の組織学的検査や神経変性の評価に使用されます。この注目のプロトコルは、1つの調製物で複数のハエを処理できるため、時間効率が向上し、実験アーティファクトが最小限に抑えられることを示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Sunderhaus and Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016)からの抜粋です。

1. 首輪に頭部を固定し、パラフィンに埋め込む

注:固定プロセスのすべてのステップは、ヒュームフード内で行う必要があります。安息香酸メチルは、健康上のリスクはありませんが、非常に独特の臭いがあり、ドラフトで取り扱わないと圧倒される可能性があります。

1. ハエに麻酔をかける前に、15 mLのクロロホルムと5 mLの氷酢酸を30 mLの99%エタノールに加えて、50 mLのCarnoy溶液を作ります(クロロホルムと酢酸を混合しないでください)。結晶化皿のような底が平らなガラス容器に注ぎ、首輪が平らになり、溶液で完全に覆われていることを確認します。
2. ハエを_CO2またはエーテルで麻酔します。
3. 糸は、鉗子を使用して首から首輪に飛び込みます(ほとんどの襟で最大20本)。図 1 A に見られるように、すべての頭部を同じ向きに整列させることを忘れないでください。また、頭部や目に損傷が生じないように優しくしてください。
4. sine oculis のハエ (矢印、図 1A) をランダムな位置に含めて、ハエの順序をセクションで簡単に識別できるようにします。さらに、実験用のハエの目の色が明るいまたは白い場合は、野生型などの赤い目のハエをそれらの間に通して、スライドを染色するのに十分な色素が存在することを確認します。ハエの順序を、複数のカラーを使用している場合はカラー番号とともにプロトコルシートに記録します。
5. カラーが完成したら、準備したCarnoy溶液に3.5〜4時間入れます。
6. Carnoy溶液を適切な廃棄キャニスターに捨て、エタノール洗浄を開始します。容器内のカラーの配置を邪魔しないように、ゆっくりと注い
でください。
7. カラーを99%エタノールで30分間2回洗います。
8. 首輪を100%エタノールで1時間洗い、過度の脱水症状を防ぐために、時間通りに洗濯を変更してください。
9. RTでメチル安息香酸O / Nにカラーを入れ、メチル安息香酸の蒸発を防ぐためにパラフィルムで容器を密封します。
10. メチルベノゼートをドラフト内の適切な使い捨て容器に注ぎます。1:1の低融点(56 - 57 °C)パラフィンワックスと安息香酸メチルの混合物をあらかじめ調製しておいたものを加えます。この時点から、カラーはパラフィンが固まらないように65°Cのインキュベーターに保管する必要があります。
11. メチルベノゼートとパラフィンの混合物を適切な使い捨て容器に注ぎ、65°Cに保たれた溶融した純粋なパラフィンワックスをカラーに注ぎます。
12. 30分後にパラフィンを交換し、これを少なくとも5回繰り返します。少なくとも6〜8回の洗浄を行う必要があります。
13. 洗浄が完了したら、カラーとほぼ同じサイズのスロットが付いたゴム製のアイスキューブトレイにカラーを置きます。完全に覆われるまで溶融パラフィンをそれらの上に注ぎ、O / Nが硬化するのを待ちます(気泡を避けてください)。
14. カラーを含むパラフィンブロックを角氷トレイから取り出します。かみそりの刃を使用してパラフィンブロックを首輪から分離し、首輪をそっと折ります。頭はパラフィンブロックにあり、体は襟にとどまります。ブロックは室温で保管できます。
15. カラーを洗浄するには、カラーを65°Cの脱パラフィン化剤に浸してパラフィンを除去し、軽くこすって洗浄し、エタノールで洗浄してから再利用します。

結果

図1:パラフィンシリアルセクション。A) カラー法では、実験フライとコントロールフライを1つのカラーに通すことで、1つのサンプルとして処理することができます。目のない正弦波バエは、向きのために挿入されます(矢印)。B)カラーのフライヘッドの向きを示す概略図。C)この画像では、さまざまなフライヘッドのセクションがスライド上で左から右に向けられています。スライドの上から下に、同じフライヘッドの連続セクションを見ることができます。この場合、sine oculis flyが位置3(矢印)に挿入されました。切片は、切断後に切片を洗い流す蛍光眼顔料によって染色されます。A = 5 mmおよびC = 0.5 mmのスケールバー

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
襟	ジェネシー・サイエンティフィック	TS 48-100	ジェネシーのもののようにレイヤーではなく、1枚の金属片から作られたカスタムメイドの首輪を使用しています。
埋め込み用ゴム製アイスキューブトレイ	家庭用品店		サイズは、追加の壁に接着することでフィットさせることができます
結晶化皿	フィッシャーサイエンティフィックカンパニー	08-762-3
エーテル	フィッシャーサイエンティフィックカンパニー	E138-1
エタノール	株式会社デコンラボラトリーズ	2701
チョロロホルム	フィッシャーサイエンティフィックカンパニー	C298-500
氷酢酸	フィッシャーサイエンティフィックカンパニー	A38-212
安息香酸メチル	フィッシャーサイエンティフィックカンパニー	M205-500	独特の臭い - ヒュームフードに使用してください!
低融点パラフィンワックス	フィッシャーサイエンティフィックカンパニー	T565	65°Cのウォーターバスで余分に溶かしてください

名