成虫のショウジョウバエの注射:化合物またはラベル送達の方法

要約

出典:Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, using an in vivo Phagocytosis Assay.J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、生きた成虫のハエの注射方法を説明し、標識された粒子とトリパンブルーをハエの腹部に注入して食作用をアッセイするプロトコルの例が含まれています。

プロトコル

このプロトコルは、Nazario-TooleとWu、Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。

1. 注射用のフルオレセイン粒子を準備します

1. フルオレセインで標識した市販の熱死菌粒子10 mg(材料表を参照)を、990 μLの滅菌1x PBSと10 μL 50 mMアジ化ナトリウムを添加して、ストック濃度10 mg/mLに再構成します。渦を混ぜます。
   1. 0.2 mLチューブ内のシングルユース8 μLアリコートに分割し、4°Cの暗所ボックスに保存して、光に関連する感度を最小限に抑えます。
      注:アジ化ナトリウム防腐剤はオプションであり、10 mg/mLのストックを1 mLの滅菌1x PBSで作製し、分注し、-20°Cで保存する場合は省略できます。
2. 500 μLシリンジでろ過した緑色の食品着色料と9.5 mLの滅菌済み1x PBSを混合して、1x PBSに5%食品着色料の10 mL溶液を調製します。
3. 注入前に粒子を洗浄して、アジ化ナトリウムを除去します。1.7 mLチューブに、滅菌済みの1x PBS42 μLと10 mg/mLの8 μLを混合します。室温で最高速度で2.5分間遠心分離します。
   1. 上清を取り除き、1x PBSを50 μL加え、室温で最高速度で2.5分間遠心分離します。
   2. 手順1.3と1.3.1を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。
   3. 最終洗浄後、上清を廃棄し、粒子を1x PBS中の5%食品着色料50μL中1.6 mg/mLに再懸濁します。
   4. 光から保護するために、チューブをアルミホイルで包みます。4°Cで保存し、1週間後に廃棄してください。

2.注入ステーションとフライを準備します

1. インジェクションパッドを準備します。ハエの遺伝子型を最大4つまで同時に注入するには、実験用テープを使用して長方形のCO₂フライパッドを4つのセクションに分割します。顕微鏡の近くのベンチで、ハエがパッドに並んだらバイアルを置く場所を指定します(パッドの各角に1つずつ)。
2. 年齢が一致した、4〜7日齢のハエのバイアルを注射用に調製します。試験する各株について、5匹の雄と5匹の雌を、調製したフライフードの新鮮なラベル付きバイアルに移し、25°Cに保ちます。
3. 機器を100ms(液体を排出するためのガス圧の短いバースト-サブナノリットルのボリュームの供給を可能にする)TIMEDモードに設定して、空気圧インジェクター(材料の表を参照)を準備します。
4. 顕微鏡スライドを準備します。1.5インチの電気テープをカットし、接着剤面を上にしてループに折り、ラベル付きの顕微鏡スライドに置きます。

3. ガラスキャピラリーニードルを用意

する

1. ニードルプラーを使用してガラス針(薄肉ガラス毛細血管)を引っ張ります。
   1. マイクロメーターで針を顕微鏡下に保持し、#5の細い先端のステンレス鋼ピンセットを使用して先端を壊します。100μmの先端は、傷を最小限に抑えながらフライのキューティクルを貫通するのに十分です。
   2. 各フライに注入される液体の量を測定します。1x PBSに滅菌5%食品着色料をニードルにロードし、0.01mmステージマイクロメーター上の鉱物油の滴に液体を排出します
      注:液滴が球形の場合、ピコリットル単位の体積は (size)³/1910 として計算されます。直径100μmの針は、100msで~2nLを排出します。

4. ハエを注入

する

1. 1.6 mg/mLの粒子10 μLを小さな正方形のパラフィルムにピペットで移します。
   1. 液体を針に引き込み、インジェクターノズルに取り付けます(材料の表を参照)。
   2. 麻酔はCO₂で飛行し、腹側を上にしてヘッドをパッドの前面に向けて、フライパッドの指定された領域に並べます。ベンチの対応する領域にバイアルを置きます。
   3. 腹部の上部隅に5, 100 msの液体ポンプ(合計~10 nL)をハエを注入します。
   4. 注入したハエを適切なバイアルに移し、バイアルの時間を書き留めます。25°Cに保ちます。
2. 新しい針に0.4%トリパンブルー溶液をロードします。
3. 空気圧インジェクターをGATEDに設定すると、一定の空気の流れで液体が針から押し出されます。
4. 麻酔薬は、30分間休んだ後に飛び、腹部がいっぱいで膨らむまでトリパンブルーを注射します。
   注:pH感受性色素で標識された粒子でファゴソームの成熟を調べる場合は、ハエを1時間休ませ、トリパンブルーを注入しないでハエをマウントしてください。
5. ハエを電気テープで顕微鏡スライドに取り付け、腹側を下にして取り付けます。ウィングをフライの側面に押し込み、テープに固定します。また、ヘッドをテープにそっと押し込んで、フライが動かないようにします。

材料

<テーブル fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> この記事で使用された材料の一覧 名前 会社 カタログ番号 コメント 5430-10 PicoNozzleキット 世界の精密機器 5430-10 1.0mmピペット用ホルダー 大腸菌(K-12株)BioParticles、フルオレセインコンジュゲート Invitrogen E2861 FITC(フルオレセイン)で標識された大腸菌を殺しました。食細胞の認識とグラム陰性菌の取り込みをテストするために使用します。(~494/~518 nm) ニードルピペットプーラー デビッド・コップフ・インスツルメンツ モデル725 空気圧ピコポンプPV820 世界の精密機器 SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820は、差圧を使用して注入の合間にガラス針に液体を保持します。ユーザーは、液体を排出するためにガス圧の短いバーストを手動で制御し、サブナノリットルの容量の供給を可能にします。
供給される液体の量は、ガラス針の開口部のサイズと注入圧力が適用される時間という2つの主要な変数に依存します。装置を100ミリ秒の「TIMED」モードに設定します。 薄肉ガラスキャピラリー 世界の精密機器 TW100F-3 注射用の針。外径 = 1.0 mm トリパンブルーソリューション(0.4%) シグマ T8154 フルオレセイン、Alexa Fluor、またはTexas Red標識粒子の細胞外蛍光を消光するために使用されます。