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$$\longrightharp{xx}$$,
このプロトコルは、Bantel and Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016)からの抜粋です。
1. 飢餓
- ハエ飢餓バイアルを調製するには、標準的なハエバイアルの底に綿球を18.2MΩの水で飽和させます。あるいは、同様に、濾紙の小さなストリップを18.2MΩの水で飽和させ、バイアル内に斜めに置きます。
- CO2 パッドでハエを ~100 匹のセットに集め、準備したバイアルにハエを追加します.
注:最良の結果は、生後5日未満の動物で得られます。しかし、動物の正確な年齢は、時間の経過に伴う味の好みの変化を決定するための実験変数として制御できます。
- コットンボールまたはフォームストッパーを使用して、バイアルを閉じます。バイアルを横にして、環境制御されたインキュベーターに入れます。温度を25°Cに、湿度を70%以上に保ちます。バイアルを24時間手つかずのままにしておきます。
2. 味嗜好アッセイ
- テストと同じ日にアッセイのすべてのテイスタントを準備します.
注:使用する正確なテイスタントは、尋ねられる実験的な質問によって異なります。以下は、このプロトコルで使用されるサンプルです。最適化については、セクション 4 を参照してください。
- 100 mMスクロース溶液10 μl、赤色食品着色料13 μl、18.2 MΩ水977 μlを組み合わせて、コントロールタスタント(1 mMスクロース)を調製します。
- 100 mMスクロース溶液50 μl、青色食用色素10 μl、18.2 MΩ水940 μlを組み合わせて、実験用タスタント(5 mMスクロース)を調製します。
- 以下の方法で調製した標準的な100 mm x 15 mmプラスチックシャーレを使用してアッセイチャンバーを作製します。
- 10 μlのコントロールテイスタントをプレートの端に最も近い12時位置に3滴、6時位置にさらに3滴を置きます。液滴の間隔が同じであることを確認してください。
- 10 μlの実験用試飲剤をプレートの端に最も近い3滴の3時位置に置いておき、さらに3滴を9時の位置に置きます。液滴の間隔が同じであることを確認してください。
- 手順 2.2.1 と 2.2.2 を繰り返して、必要な回数だけ反復します。
- ~100匹の飢餓状態のハエが入った空のバイアル1本を、すべての動物に麻酔をかけるのに十分な長さ(約10秒)のCO2パッドに置きます。準備したアッセイチャンバーの中央に動物をブラシで入れ、皿の蓋で覆います
注:回復時間を改善し、摂食行動への干渉を制限するために、CO2への長時間の曝露は避けるべきです。氷への曝露 (~5 分) は、限られた曝露から生じる可能性のある CO2 の行動への影響を回避するための麻酔に使用できます。
- アッセイチャンバーを不透明な段ボール箱に入れます。箱の外側には、テストする状態と遺伝子型を必ずラベル付けしてください。
- セットアップ全体(ステップ2.4の段ボール箱に入っているアッセイチャンバー)を、湿度70%以上の25°Cのインキュベーターに2時間入れます。
- すべての反復について、手順2.3から2.5を繰り返します。
- 2時間後、段ボール箱に入ったままのアッセイチャンバーを、定量の準備ができるまで-20°Cの冷凍庫に直接入れます。
3. 味嗜好アッセイの定量化
- 1つのアッセイチャンバーを室温まで温めます(約5分)。
- 解剖顕微鏡下で、ブラシまたは一対の鉗子を使用して、腹部の色に基づいて動物をグループ化します:赤、青、紫、または透明（図1)。
- 各グループの動物の数を記録します。透明な動物はアッセイに参加していないため、計算に含めないでください。
- 選好指数は、次のいずれかの式に従って計算します。
- 目的の実験テイスタントを赤色色素に添加する場合は、(Nレッド+0.5Nパープル)/(Nレッド+Nブルー+Nパープル)を使用します。
- 実験的なテイスタントを青色色素に添加する場合は、式を(N青+0.5N紫)/(N青+N赤+N紫)に調整します。
- すべての実験条件と反復について計算を繰り返します。
4. Taste Preference Assayの最適化
- 次のように、食品着色料が味覚アッセイの結果に影響を与えないように、使用する食品着色料指標の濃度を経験的に決定します。
- ステップ2.1で示されたのと同じベース化合物(例:5 mMスクロース)を使用して4つのテイスタントを準備しますが、食品着色料は省略します。
- テイスタントの1つに1.3%の赤い食用着色料を追加します。残りの3つのテイスタントを、各チューブでさまざまな濃度の青い食用色素(0.6%、1%、1.3%など)で作ります。
- 各試飲ペアについて、プロトコルのステップ2.2から3.4を完了します:赤1.3%対青0.6%、赤1.3%対青1%、赤1.3%対青1.3%
。
- 選好指数が平均値0になるまで、青色の食用色素の割合を変えてステップ4.1.1-4.1.3を繰り返します(図2).
注:出発点として、1.3%の赤い食用着色料と1%の青い食用着色料を組み合わせると、通常、良好な結果が得られます。1.3%染料に十分な濃度の青色の食用色素を一致させることができない場合は、ステップ4.1.1から4.1.3を、さまざまな濃度の赤色着色料と一定濃度の青色食品着色料で繰り返すことができます。
- 試験するすべての条件を、最適化された同じ食品着色料濃度で分析します。
